大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。

植物抗旱相关基因研究进展

遭遇极端温度、干旱、高盐等胁迫时,植物需要调控多种基因,通过多种途径来抵御非生物胁迫的伤害。综述了植物在干旱胁迫发生时,信号传导和转录因子相关调控基因以及在水分运输、抗脱水、渗透调节以调节气孔开关等功能相关基因克隆的研究进展,并提出了今后开展植物抗逆研究的建议。

11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析

根据基因库中新城疫病毒(NDV)的NP基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的11株NDV毒株NP基因进行RT-PCR扩增和序列测定,拼接出11个NDV广西分离株的NP基因的全序列,10个NDV广西分离株的NP基因阅读框的核苷酸序列全长均为1470 bp,编码489个氨基酸,它们的NP基因核苷酸全序列及推导的氨基酸全序列与10个已发表的NDV参考株的NP基因全序列比较分析结果表明:核苷酸序列同源性为84.8%～98.2%,氨基酸同源性为89.8%～99.4%.

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据。方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465bp的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况。结果经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体。结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究。

杨梅超氧化物歧化酶SOD2同源基因片段的克隆及序列分析

根据植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的保守区设计特异性引物,通过RT-PCR技术,克隆杨梅叶超氧化物歧化酶保守区之间的cDNA序列。该序列长233 bp,编码一段由77个氨基酸残基组成的SOD保守区片段,该肽段具有Cu/Zn SOD的特征序列。序列同源性分析表明,该序列与Genbank中已有的其他植物SOD序列的同源性均在86%以上。该基因命名为MrSOD2(Genbank登录号为AB661320)。

鸭Rab6基因cDNA的克隆及组织特异性表达

【目的】研究鸭Rab6基因序列并进行序列分析,揭示该基因的组织特异性表达规律。【方法】运用RT-PCR技术获得鸭Rab6基因序列,并用半定量RT-PCR方法研究该基因的组织特异性表达规律。【结果】从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了Rab6基因的cDNA序列,大小为761bp,包含1个627bp完整开放阅读框,编码208个氨基酸。该序列与小鼠、狗、人等物种的Rab6有86.1%～93.1%的同源性,而相应蛋白的同源性达97.6%以上。蛋白预测的分子量为23534D,等电点预测为5.42,该蛋白在78～102氨基酸处有1个跨膜结构,这些特征与人、小鼠、狗等物种高度相似。半定量RT-PCR研究结果显示,Rab6基因在所测组织中均表达,在小肠、肝、脾、间脑、肾、脂肪组织中高度表达,腺胃、骨骼肌、肌胃组织中中度表达,心、肺、卵巢中低度表达。【结论】Rab6基因在动物进化中具有高度保守性,具有相似的生物学功能,该基因的表达具有组织特异性。

RASSF1B基因的克隆及序列分析

目的克隆RASSF1B基因并观察其序列。方法采用RT-PCR从胃腺癌细胞AGS、肝癌细胞HEPG2、高转移肺癌细胞95D、肺腺癌细胞LTEP-a-2、白血病细胞U937中克隆RASSF1B基因,用生物信息学方法对克隆基因的序列进行分析。结果RASSF1B在5种肿瘤细胞中均有表达。序列分析显示,该基因中有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。结论在胃腺癌、肝癌、高转移肺癌、肺腺癌、白血病细胞中成功克隆出RASSF1B基因,该基因序列中含有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定

目的获取幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因的序列,预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA,使用PCR扩增hpaA基因,克隆入pGEM-T载体中测序,并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果同源性分析表明hpaA具有很高的保守性,成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论hpaA具有高保守性,在Hp各菌株中普遍存在,是有良好应用前景的Hp候选疫苗。

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactatedecarboxylase,ALDC,EC.4.1.1.5)基因序列,利用PCR方法从产气大肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆到0.8 kb的DNA片段,经DNA序列分析表明该DNA片段为ALDC基因.将该片段插入到原核表达载体pBV220中,获得表达质粒pBVEDAD,转化大肠杆菌DH5α(Escherichia coli),经热诱导后,通过SDS-PAGE分析和酶活测定,结果表明ALDC获得了高效表达.重组细胞表达的ALDC酶活是出发菌产气肠杆菌(E.aerogenes)的1 100倍.DH5α(pBVEDAD)在无选择压力下37℃连续培养60代,在42℃下热诱导5 h未见质粒丢失.

植物细胞色素P450在三萜皂苷生物合成中的功能研究进展

三萜皂苷是许多药用植物的药效成分,其生物合成通常可分为前体形成、骨架构建以及后修饰3个部分。后修饰过程是植物调控形成众多种类单体皂苷的重要过程,其机制至今尚未完全阐明。植物细胞色素P450是由少数几个超基因家族编码的,参与多种生物过程,包括三萜皂苷次生代谢的后修饰过程。目前,已在少数植物中克隆到了催化个别单体皂苷生物合成的P450基因,其功能研究取得了一定进展。将就此进行综述,为进一步开展相关研究提供借鉴。

携带人降钙素基因相关肽基因的重组逆转录病毒的构建及鉴定

目的构建、鉴定携带人降钙素基因相关肽a（hCGRPa）的重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPa。方法采用基因工程技术，双酶切消化后回收438bp的hCGRPacDNA片段和6．1kb的pLNCX2载体片段，纯化后按摩尔比7：1混合，将降钙素基因相关肽基因片段克隆至逆转录病毒载体pLNCX2上，序列测定、对比。鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行病毒包装扩增，感染NIH3T3细胞，观察细胞克隆，测定病毒滴度。结果酶切、测序结果与hCGRPa基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致，分别为6．1kb和438bp，与空载体和目的基因大小相符。包装、扩增获得病毒滴度达1．7×10^6pfu／ml，对NIH3T3细胞有较高的感染效率。结论成功构建重组逆转录病毒pLNCX2-hCGRPoL，为进一步的基因治疗研究奠定了实验基础。

粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达

目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。