gp150蛋白在盘基网柄菌发育中的作用及粘附分子间关系的分析

饥饿的盘基网柄菌进入多细胞发育期 ,在发育早期 ,AK12 7细胞 (gp150突变细胞 )能表达DdCAD 1和 gp80两种粘附分子 ,但它们不足以促进细胞继续发育 ,发育停留在细胞疏松结合阶段。粘附分子 gp150调节的细胞与细胞间的粘着影响了细胞丘“突出”的形成 ,由此影响了盘基网柄菌多细胞发育的形态发生。TL93细胞 (DdCAD 1和gp80突变细胞 )能完成发育。主要原因是在细胞流发育阶段就表达了gp150分子 ,在细胞粘着的功能上有替代DdCAD 1和 gp80的作用。因此

盘基网柄菌柄细胞分化过程中gp150分子的作用

饥饿的盘基网柄菌进入多细胞发育期后,在细胞疏松结合阶段,gp150分子分布在多细胞体外周;在蛞蝓体阶段,gp150分子把蛞蝓体分成前孢子细胞区和前柄细胞区两个部分,在分化成柄细胞的区域内gp150分子的量逐渐增多.实验结果表明gp150分子与柄细胞分化有密切关系.

盘基网柄菌细胞发育中gp150分子与凋亡蛋白作用分析

用Percoll密度梯度技术分离和收集盘基网柄菌前柄和前孢子细胞,Western blot分析gp150分子和胱天蛋白酶在前孢子细胞和前柄细胞两种类型细胞中的表达情况.结果显示:只能在前柄细胞中检测到gp150蛋白条带,并随细胞发育蛋白的量逐渐增加,提示gp150蛋白的表达量与发育时间,前柄细胞分化有密切关系;在前柄细胞中能检测到31.5kD和37.5kD分子量大小的凋亡蛋白,且蛋白量也是随发育时间有所增加,在两种类型细胞中都可检测38.2kD的凋亡蛋白.这些数据表明盘基网柄菌细胞凋亡过程中有类似Caspase-3的蛋白表达,它们的存在与细胞凋亡存在密切关系;gp150分子的表达与胱天蛋白酶的激活可能存在一定关系.

盘基网柄菌粘附分子gp150的定位及其与PKA活性关系的研究

细胞粘附分子gp150在盘基网柄菌细胞发育后期起着重要作用.用gp150抗体定位gp150在细胞发育重要阶段的分布,显示在细胞发育的不同时段,gp150的定位有着明显的区别.在聚集前的细胞流时期,gp150还均匀分布在细胞质内,到了细胞丘时期,gp150就移至多细胞聚集体的边缘部位.到了蛞蝓体时期,gp150在前柄细胞的表达量明显大于前孢子细胞,提示了gp150对柄细胞的作用.而当细胞发育至子实体阶段,gp150大量分布在成熟孢子的孢壁上,这是目前还没有报道的.高效液相色谱法检测野生型KAx-3细胞和gp150过表达细胞KAx-3:acct15/lagC的PKA活性,显示在细胞发育的早期(10 h之前),PKA在野生型细胞中的活性比KAx-3:act15/lagC细胞低.但是在细胞发育的后期,也就是野生型细胞中gp150开始快速积累之后,PKA在野生型细胞中的活性比KAx-3:act15/lagC细胞高.这些结果说明,gp150和PKA之间可能存在某种负反馈环的关系共同调节盘基网柄菌的生长发育.

盘基网柄菌发育期间gp150蛋白与蛋白激酶A相关性的研究

盘基网柄菌进入多细胞发育阶段后，野生型KAx-3细胞的盘基网柄菌蛋白激酶A（DdPKA）活性分别在12，16，20h时显著升高，这一变化趋势与细胞形态学上的分化有关；而突变型AK127细胞（gp150蛋白缺失）的DdPKA活性则一直保持在较高水平，直至22h才缓慢下降。两种细胞类型中24h的DdPKA活性都再一次升高。总体而言，AK127细胞的DdPKA活性要比KAx-3细胞高。这表明AK127细胞可能因缺失了gp150蛋白而导致DdPKA活性调控失去控制。在KAx-3细胞的分化过程中，前柄细胞（prestalk cells，pst）DdPKA的活性在16～18h缓慢上升，但在20h时显著下降；前孢子细胞（prespore cells，psp）中DdPKA的活性在18h时显著下降，但在20h时又迅速恢复，并达到前柄细胞中DdPKA活性的两倍。激光共聚焦结果显示，在KAx-3发育的关键阶段，DdPKA两种亚基的胞内定位并不一致，DdPKA-R亚基在空间位置上更为靠近gp150蛋白，甚至互相重叠。以上结果表明，gp150蛋白可能通过影响DdPKA-R的活性来调控前柄细胞的凋亡和前孢子细胞的分化。

盘基网柄菌中gp150分子相互作用蛋白质的分离及分析

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达编码盘基网柄菌中gp150蛋白C末端的基因,得到含有gp150蛋白C末端肽段及6个组氨酸标签的融合蛋白。通过镍柱亲和层析纯化得到纯度在90%以上的目的蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。所得抗体经Western blot检测有较好的抗gp150的特异性,ELISA法测定效价达1:128 000后用于免疫共沉淀,从发育16 h的盘基网柄菌细胞全蛋白中成功分离出两个与gp150蛋白相互作用的蛋白质。通过质谱分析鉴定,分别为40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24(RPS24)蛋白,两蛋白在细胞周期调控、细胞发育及凋亡过程中有着重要作用。实验结果提示在盘基网柄菌多细胞发育中gp150蛋白可能与RPS3和RPS24发生相互作用,借此调节了细胞分化和发育。

盘基网柄菌野生型KAx-3和突变型AK127细胞mRNA差异显示分析

为研究gp150蛋白调控盘基网柄菌发育相关基因的功能,用mRNA差异显示技术比较分析盘基网柄菌发育14h的KAx-3细胞和AK127细胞.结果显示两种类型细胞基因表达有明显差异,突变细胞不能表达275bp片段.对其测序分析后发现差异片断与编码组氨酸激酶、STATc蛋白及同源框蛋白等的基因中的一段序列有很高的相似性.推测gp150蛋白的缺失引起某些调控因子表达异常,从而使突变细胞的基因表达不正常,最终导致细胞不能完成多细胞发育.

盘基网柄菌发育中尿囊酸酶表达的定量定位研究

用免疫荧光技术对KAx-3多细胞发育不同阶段的尿囊酸酶进行定位观察,用Westernblot分析野生型细胞KAx-3和突变型细胞AK127多细胞发育中尿囊酸酶的表达情况.结果显示:在细胞聚集阶段,尿囊酸酶在盘基网柄菌细胞膜附近存在较多;在细胞丘阶段,尿囊酸酶在细胞丘外层细胞中荧光强度较强;在蛞蝓体阶段,尿囊酸酶在前柄细胞中的表达量明显多于前孢子细胞;在子实体成熟的过程中,在前柄细胞区与前孢子细胞区交界处荧光强度最强,该区域内细胞将分化成前柄细胞B.据此推测尿囊酸酶的定位表达可能与盘基网柄菌细胞分化的类型相关.Western blot结果显示:在KAx-3发育过程中尿囊酸酶的表达量呈现出逐渐上升的趋势,发育至18 h左右达到最大值;而AK127中尿囊酸酶的表达量始终在低水平徘徊.这表明gp150的缺失影响了尿囊酸酶的表达.实验结果提示,尿囊酸酶的表达量与发育时间有关,并且这种表达量的变化与gp150存在着密切的关系.

NewStar150GPS原理实验平台在《GPS原理与应用》教学中的应用

NewStar150GPS原理实验平台为学生提供开放式的实验环境,使学生在真实设备、真实卫星信号环境下,亲自动手进行实验和编程,理解单向测距原理。同时掌握GPS测量误差和信号传输误差特性,以及实时GPS卫星位置及Doppler频移的预测方法等接收机核心技术。通过实验,学生能够加深对GPS系统结构、工作原理和工作过程的理解,掌握GPS接收机核心算法导航解算过程,NewStar150GPS原理实验平台在GPS原理与应用教学中起到了良好的效果。

GP460/150型破碎机常见电气故障的原因分析与处理方法

基于GP460/150型给料破碎机在神东煤炭集团投入使用的运行情况,分析了破碎机常见电气故障发生的原因,总结了此类故障的处理方法,降低破碎机的故障率,保证设备正常运转安全生产。

人巨细胞病毒gp52-pp65-pp150的融合表达及应用

目的克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)特异性强的抗原决定簇基因,制备并纯化重组蛋白,并通过组装成捕获法ELISA试剂盒对其抗原性进行评价。方法提取人巨细胞病毒AD169株的DNA,用PCR扩增HCMV的pp150(UL32)、gp52(UL44)、pp65(UL83)基因片段,将3个基因片段串联克隆至原核表达载体pGEX-5x-3进行融合表达和纯化,采用SDS-PAGE电泳法和免疫印迹法(Western blot)对融合基因的克隆及重组蛋白的表达进行鉴定,并组装成捕获法ELISA试剂盒对临床标本进行检测,评价试剂盒的各项性能指标。结果经序列测定各基因片段序列正确,成功构建了HCMV的高效表达融合基因的重组载体gp52-pp65-pp150,表达的融合蛋白经Western blot分析,分子量在50 ku,具有良好的抗原性。将该蛋白组装成捕获法ELISA试剂盒,经232份血清标本的检测,与进口试剂盒相比,本试剂盒的灵敏度为93.91%;特异度为97.43%;粗一致性为96.1%;约登指数为0.901;批内变异系数为12.4%;稳定性良好,37℃保存试剂与4℃保存试剂进行对照试验,变异系数为13%。结论本实验通过基因工程技术的方法有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原(gp52-pp65-pp150重组蛋白),该融合蛋白构建的捕获法ELISA试剂与进口试剂盒比对,具有较高的灵敏度和特异性,经初步临床应用,具有进一步开发应用的价值,为不同临床感染阶段的HCMV的检测提供了技术基础。