盘基网柄菌野生型KAx-3和突变型AK127细胞mRNA差异显示分析

为研究gp150蛋白调控盘基网柄菌发育相关基因的功能,用mRNA差异显示技术比较分析盘基网柄菌发育14h的KAx-3细胞和AK127细胞.结果显示两种类型细胞基因表达有明显差异,突变细胞不能表达275bp片段.对其测序分析后发现差异片断与编码组氨酸激酶、STATc蛋白及同源框蛋白等的基因中的一段序列有很高的相似性.推测gp150蛋白的缺失引起某些调控因子表达异常,从而使突变细胞的基因表达不正常,最终导致细胞不能完成多细胞发育.

盘基网柄菌发育期间gp150蛋白与蛋白激酶A相关性的研究

盘基网柄菌进入多细胞发育阶段后，野生型KAx-3细胞的盘基网柄菌蛋白激酶A（DdPKA）活性分别在12，16，20h时显著升高，这一变化趋势与细胞形态学上的分化有关；而突变型AK127细胞（gp150蛋白缺失）的DdPKA活性则一直保持在较高水平，直至22h才缓慢下降。两种细胞类型中24h的DdPKA活性都再一次升高。总体而言，AK127细胞的DdPKA活性要比KAx-3细胞高。这表明AK127细胞可能因缺失了gp150蛋白而导致DdPKA活性调控失去控制。在KAx-3细胞的分化过程中，前柄细胞（prestalk cells，pst）DdPKA的活性在16～18h缓慢上升，但在20h时显著下降；前孢子细胞（prespore cells，psp）中DdPKA的活性在18h时显著下降，但在20h时又迅速恢复，并达到前柄细胞中DdPKA活性的两倍。激光共聚焦结果显示，在KAx-3发育的关键阶段，DdPKA两种亚基的胞内定位并不一致，DdPKA-R亚基在空间位置上更为靠近gp150蛋白，甚至互相重叠。以上结果表明，gp150蛋白可能通过影响DdPKA-R的活性来调控前柄细胞的凋亡和前孢子细胞的分化。

盘基网柄菌中gp150分子相互作用蛋白质的分离及分析

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达编码盘基网柄菌中gp150蛋白C末端的基因,得到含有gp150蛋白C末端肽段及6个组氨酸标签的融合蛋白。通过镍柱亲和层析纯化得到纯度在90%以上的目的蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。所得抗体经Western blot检测有较好的抗gp150的特异性,ELISA法测定效价达1:128 000后用于免疫共沉淀,从发育16 h的盘基网柄菌细胞全蛋白中成功分离出两个与gp150蛋白相互作用的蛋白质。通过质谱分析鉴定,分别为40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24(RPS24)蛋白,两蛋白在细胞周期调控、细胞发育及凋亡过程中有着重要作用。实验结果提示在盘基网柄菌多细胞发育中gp150蛋白可能与RPS3和RPS24发生相互作用,借此调节了细胞分化和发育。