gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

蓖麻蚕核型多角体病毒基因gp64的克隆及荧光定量表达分析

Gp64是杆状病毒CRV(Cell-released virus)的主要嚢膜蛋白,在CRV借吸附和内吞作用侵入细胞过程中起关键作用,能促进CRV嚢膜与胞饮体膜之间的融合从而促进杆状病毒对宿主细胞的吸附。本试验克隆了蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricini nuclear polyhedrosis virus,PcrNPV)的gp64基因,序列分析表明该基因ORF全长1 530bp,编码509个氨基酸残基,其相应的GP64蛋白质分子量为58.46kD,等电点为5.59;同源性分析表明,PcrNPV的GP64蛋白与柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus,ApNPV)的GP64同源性高达99%,而与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,BmNPV)的GP64仅为76%;荧光定量分析表明,PcrNPV的gp64基因在不同蓖麻蚕品种的中肠、血液及其脂肪体中均有相同的增殖趋势,但在不同品种的各组织中的增殖量不同,增殖量多的品种与感染试验中相对易感的品种一致。

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因克隆与序列分析

【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据。【方法】对广西不同桑蚕产区的19株Bm NPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树。【结果】广西Bm NPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西Bm NPV毒株中出现。仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%。19株广西Bm NPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性。【结论】广西Bm NPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点。

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21(DE3)细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。

广西家蚕核型多角体病毒gp64基因遗传多态性及进化分析

【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)gp64基因的遗传多态性及进化特点,掌握BmNPV在广西蚕区的流行和传播情况,揭示BmNPV种群维持遗传多样性的模式与机制。【方法】对20株广西BmNPV毒株的gp64基因进行测序分析,根据gp64基因构建遗传进化树及绘制毒株流行分布图,并比对不同毒株的致病力。【结果】广西BmNPV毒株gp64基因开放阅读框(ORF)长度存在3种情况(1590、1593和1599 bp),分别编码含529、530和532个氨基酸残基的GP64蛋白。20株广西BmNPV毒株与标准参考T3株的gp64基因核苷酸序列同源性在97.6%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在96.4%~99.6%。在广西BmNPV毒株gp64基因近N端分别出现GCG缺失和GCGCCG/GTGCCG插入突变,发生核苷酸替换突变的位点数目在13~28个,但大部分为同义替换,对编码蛋白的三聚体空间构象无明显影响。广西BmNPV毒株gp64基因编码蛋白的N-糖基化位点为3~4个;除GXZS株外,所有毒株的O-糖基化位点均为2个,且预测位点一致。基于gp64基因构建的遗传进化树显示,几乎所有的广西BmNPV毒株聚类于Clade Ⅰ分群,其又被分为2个主要亚群(Sub-clade Ⅰ和Sub-clade Ⅱ);而几乎所有的国外参考毒株聚类于Clade Ⅱ分群。广西蚕区的BmNPV流行分布呈集中性与分散性并存;GXUA株对四龄和五龄起蚕的半数致死量(LD_(50))分别为3.3和3.1,而GXZZ株对四龄和五龄起蚕的LD_(50)分别为5.5和5.3,说明GP64蛋白糖基化位点较少的BmNPV毒株表现出较弱的致病力。【结论】广西BmNPV毒株gp64基因在进化过程中其信号肽区出现明显变异,发生同义突变的频率较高,形成较独立的进化分群,毒株间的致病力差异可能与GP64蛋白糖基化位点不同有关,说明广西BmNPV毒株具有不同的基因型和表型,在一定程度上维持了BmNPV野生群体的遗传多样性。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因的原核表达

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白Gp64是杆状病毒感染宿主细胞的重要功能蛋白之一.通过Oligo6.0设计一对特异性引物,用于扩增Gp64基因的部分DNA片段,对聚合酶链式反应扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同尾酶双酶切后的原核表达载体p ET28a进行连接;对捕获有重组质粒p ET28a-Gp64的大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行异丙基硫代半乳糖苷诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;采用电透析的方法纯化了该蛋白,为进一步制备抗Gp64蛋白抗体做准备.

豆天蛾核型多角体病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

从豆天蛾幼虫虫体中分离纯化出一种新型的豆天蛾核型多角体病毒（CbNPV），提取基因组DNA，进行基因组测序。结果发现一个与杆状病毒F蛋白基因同源性很高的读码框序列，该长度为2109bp，编码702个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明：CbNPVF蛋白与Ⅱ类NPV和Ⅰ类NPVF蛋白的同源性分别为32．9％～61．8％和8．0％～16．1％，并且将它与多种Ⅰ类NPV杆状病毒同功能蛋白GP64进行分析，同源性在9．1％～11．4％，表明CbNPVF蛋白与Ⅰ类NPV的F及GP64蛋白的同源性很低，因此认为CbNPV属于Ⅱ类NPV。

杆状病毒AcMNPV包膜蛋白GP64胞外区的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)包膜糖蛋白GP64胞外区,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的AcMNPV GP64基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除GP64基因信号肽和跨膜区的引物,PCR扩增GP64胞外区基因,插入原核表达载体pET-21b(+)中,转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF crude纯化后,进行SDS-PAGE和Wester blot分析。将纯化的重组蛋白经背部皮下免疫家兔,制备多克隆抗体,采用免疫染色法检测多克隆抗体对AcMNPV的中和作用。结果重组表达质粒pET-21b(+)-GP64经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 000,表达量占菌体总蛋白的46.8%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上,可与鼠抗AcMNPV GP64蛋白单克隆抗体特异性结合;制备的兔抗GP64蛋白多克隆抗体能与纯化的重组蛋白和杆状病毒发生特异性反应,抗体效价高于1∶1 000 000,其可中和100 TCID50/ml的AcMNPV,使AcMNPV无法感染昆虫细胞Sf9,中和效价为1∶8。结论成功原核表达了AcMNPV GP64蛋白胞外区,并制备了对AcMNPV有完全中和能力的多克隆抗体,为昆虫细胞/杆状病毒表达系统的应用研究及杆状病毒毒株的检定等提供了材料。