产气荚膜梭菌噬菌体及乳酸杆菌联用改善肉鸡生长性能和调节肠道菌群功能研究

【目的】明确产气荚膜梭菌噬菌体及乳酸杆菌联用对肉鸡的生产性能、肠道形态结构及微生物多样性的影响,为禽健康养殖中产气荚膜梭菌的感染提供关键防控技术。【方法】选取240只1日龄青脚麻鸡,随机分为4组:HN02噬菌体组、乳酸杆菌组、HN02噬菌体+乳酸杆菌联用组及空白对照组,每组6个重复,每个重复10只鸡,试验期14 d,期间连续每天饮用噬菌体和/或乳酸杆菌。统计平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G),计算脏器系数。取盲肠内容物测定产气荚膜梭菌数量,并对16S rRNA基因进行扩增,分析肠道微生物群落结构和多样性。【结果】与空白对照组相比,HN02噬菌体+乳酸杆菌联用能显著提高雏鸡平均日增重及绒毛高度/隐窝深度(P<0.05),显著降低雏鸡料重比和空肠、回肠隐窝深度(P<0.05),且处理14 d的抑菌效果最佳,产气荚膜梭菌的数量减少1.17 lg CFU/mL。微生物多样性显示,HN02噬菌体+乳酸杆菌联用饮水后雏鸡盲肠内容物菌群中变形菌门、厚壁菌门、放线菌门及拟杆菌门相对丰度较高,属水平中乳杆菌属相对丰度较高,与空白对照组相比,HN02噬菌体+乳酸杆菌联用连续饮用14 d后葡萄球菌属相对丰度较低。【结论】产气荚膜梭菌噬菌体和乳酸杆菌联用能够改善肉鸡的生长性能及肠道发育,维持肠道微生物群落的多样性,在养禽业的产气荚膜梭菌感染的预防中有巨大应用潜力。

异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

背景与目的:肿瘤的生长、转移和新生血管生成有密切关系,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是已知作用最强、最专一的促血管生成因子。本实验采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肺癌组织克隆出人VEGF165基因,将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b_VEGF噬菌体疫苗,制备噬菌体效价达到1×1013pfu/ml。将C57BL/6J小鼠随机分为3组,T7-VEGF疫苗组10只、空白噬菌体组(T7)10只、生理盐水组(NS)10只。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只每周分别免疫1×1012pfu/200!l重组噬菌体疫苗、空白噬菌体、生理盐水,共免疫4周。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态.接种肿瘤14天后,处死小鼠,剥离肿瘤称重,检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度、肿瘤微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果:T7-VEGF疫苗组,T7组、生理盐水组肿瘤均重分别为:(0.543±0.259)g、(0.982±0.359)g、(1.169±0.460)g。疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1∶1000。疫苗组、空白噬菌体组、生理盐水组MVD分别为:8.5±0.8,16.4±1.3,18.5±1.6。疫苗组MVD明显小于生理盐水组。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。

人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选

目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。

利用肽库技术筛选成纤维细胞生长因子的短肽亲和配体

成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）具有促进血管和神经形成的功能［１］，但它在体内作用过度则经常伴随着肿瘤的发生［２］．当前，研制和开发ＦＧＦ拮抗剂，以有效地抑制ＦＧＦ与细胞受体的结合，已成为国际性前沿课题．一种可行方法是设计合成ＦＧＦ受体结合部位的亲和配体...

十二肽库中与结缔组织生长因子特异结合噬菌体的筛选

目的:从随机十二肽库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆。方法:用基因重组方法制备硫氧化还原蛋白(TrxA)以及硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白;噬菌体肽库经TrxA预吸附后,与TrxA-CTGF结合,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取10个克隆,提取单链DNA后测序;用直接和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆与CTGF结合的特异性。结果:10个克隆中8个DNA序列完全一致(810A),另有2个有不同序列(810B,810C);3个阳性克隆用直接和间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.05)。结论:成功获得与CTGF特异结合的噬菌体克隆,为CTGF小分子抑制剂的研究打下基础。

德氏乳杆菌保加利亚亚种电转化平台的构建和优化

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisub sp.bulgaricus)是最具经济价值的乳酸菌之一,在世界上广泛应用于酸奶和其它发酵乳生产。当前对该菌的代谢机制研究甚少。外源基因的转化效率是制约其分子代谢机制研究的重要因素。本研究以pMG36c为材料,对L.delbrueckiisub sp.bulgaricus CH3进行电转化条件研究。结果表明,在电转化过程中,电场强度、质粒的浓度、细胞生长状态均对转化效率有明显影响,得到了该菌株的最适电转化条件为:对数初期的细胞,质粒浓度为100 ng/50μl菌液,在10 kV/cm电场强度下电转化,转化后细胞在复壮培养液中培养3 h后涂布选择性培养基,转化率可达2.6×103CFU/μg DNA。以甘氨酸、醋酸锂、二硫苏糖醇处理细胞壁,发现醋酸锂和二硫苏糖醇共同处理对转化效率有明显改善,可提高转化效率。

噬菌体展示技术筛选bFGF抗原表位

目的:以抗-bFGF单克隆抗体GF22为目标,用噬菌体随机七肽库进行筛选。经三轮筛选后的噬菌体阳性克隆能特异地抑制bFGF与CF22结合。测序结果表明与CF22结合的序列高度保守,为LP(P/L)GH(F/I)K,LPPGHFK与bFGF分子(155氨基酸)上22-27位氨基酸一致,表明该序列在bFGF上是一个主要的抗原表位。用此序列的阳性噬菌体克隆免疫小鼠,发现此序列摸拟肽能诱导抗bFGF抗体反应,且序列LPLGHIK诱导的抗体反应比LPPCHFK序列强三倍,序列LPLGHIK可能作为一种有价值的肽疫苗诱导抗bFGF抗体的产生。

VEGF纳米抗体的筛选、表达及特异性检测

血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异性的促血管内皮细胞生长因子,与肿瘤侵袭、转移、预后和复发密切相关。本研究为表达筛选与VEGF具有亲和特异性的纳米抗体,首先利用VEGF免疫羊驼,提取外周血淋巴细胞总RNA,构建噬菌体文库;并多次淘洗筛选到与VEGF有亲和力的克隆,筛选到10个与VEGF有亲和力的VHH基因片段。然后通过软件分析其亲水性、分子质量等理化性质,发现这10个Nb VEGF蛋白均为亲水性蛋白,其分子质量在20.1~20.7 kDa之间。同时在大肠杆菌中重组表达这10个抗体蛋白,经Ni金属螯合亲和层析纯化后的Nb VEGF的蛋白纯度均大于80%。最后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测蛋白的抗原特异性和亲和力。结果表明:有3个纳米抗体Nb VEGF-3、Nb VEGF-7和Nb VEGF-10能与VEGF特异性结合,且Nb VEGF-3的亲和力与阳性对照一致,其他纳米抗体均无VEGF抗性。本研究成功筛选并表达了3个具有VEGF特异性的纳米抗体,且其中Nb VEGF-3有较好的抗原亲和力,可能是一种抗VEGF的候选药物。

口腔癌组织中血管内皮生长因子-C在肿瘤相关巨噬细胞内的表达及与淋巴结转移的关系

背景与目的:肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAMs)和血管内皮生长因子-C(vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C)与肿瘤淋巴结转移可能有关,本研究探讨口腔鳞癌组织中VEGF-C在TAMs内的表达及与肿瘤淋巴结转移的关系。方法:采用免疫组化染色,光镜下进行巨噬细胞计数,图像分析仪检测VEGF-C的染色强度-免疫组化阳性指数(positiveindex,PI),采用免疫组化双染的方法观察TAMs内VEGF-C的表达。结果:在口腔鳞癌中淋巴结转移组VEGF-C的表达(PI=12.169±2.778)较无转移组(PI=8.498±2.674)增高(P<0.05),VEGF-C的表达和TAMs计数有关(r=0.370,P<0.05),免疫组化双染显示,VEGF-C表达阳性的巨噬细胞约占总巨噬细胞数22.8%。结论:在口腔鳞癌中不仅肿瘤细胞可以分泌VEGF-C,而且TAMs也可以分泌VEGF-C,TAMs在瘤周的淋巴管生成及淋巴结转移中可能起重要的作用。

宽噬菌谱肠炎沙门氏菌噬菌体的生物学特性

以肠炎沙门氏菌为宿主菌,对从鸡场粪尿污水中分离到的肠炎沙门氏菌噬菌体PSA-6a进行生物学特性鉴定。利用双层平板法分离裂解性噬菌体,并采用噬菌斑形态观察、透射电镜分析、噬菌谱测定、最佳感染复数和一步生长曲线等试验对分离到的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果表明该噬菌体在宿主菌ATCC 13076平板上形成的噬菌斑为透亮的空斑,直径为0.5～1.0 mm,边缘清晰,无晕环;它具有宽噬菌谱的特性,不仅可强裂解宿主菌ATCC 13076,还可裂解其他4株沙门氏菌和1株大肠杆菌K88;透射电镜观察显示此噬菌体头部呈圆形,直径约81 nm,有一长尾,尾长约200 nm;一步生长曲线显示PSA-6a潜伏期为60 min,爆发期为50 min,裂解量为22;最佳感染复数为1。

可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析

应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CH1、CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、免疫沉淀、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与S114和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显示,Fab能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的生长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并且被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子.

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析

目的分离鉴定铜绿假单胞菌噬菌体,并对其生物学特性进行研究。方法从居民生活用水下水道中分离出铜绿假单胞菌噬体,利用噬斑测定法纯化所分离的噬菌体,通过负染法电镜观察噬菌体形态及大小。观察并测定噬菌体一步生产曲线,提取噬菌体核酸并进行酶切电泳。结果利用21株铜绿假单胞菌为宿主菌,从下水道中分离出3株铜绿假单胞菌噬菌体,分别命名为PaP-c01、Pap-c02和Pap-c03。噬菌体Pap-c01能裂解6株铜绿假单胞菌,显示出较宽的噬菌谱,酶切电泳显示其基因组大小为32kb。生长曲线显示其感染宿主菌的潜伏期为30min,暴发时间为55min,裂解量为100。结论分离出的噬菌体具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量较大,为噬菌体作为生物制剂用于抗感染治疗打下了基础。

血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体肿瘤疫苗的免疫活性

目的:采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗诱导小鼠产生特异性抗体的免疫活性。方法:将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b-VEGF噬菌体疫苗。将疫苗免疫C57BL/6J小鼠。免疫4周后,用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度。结果:疫苗组血清产生较高水平抗VEGF抗体。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可打破机体对自身VEGF的免疫耐受,诱导产生较高水平的特异性抗VEGF抗体。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性。方法 对CsCl梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0 0 0 0 1、0 0 0 1、0 0 1、0 1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,3 7℃160r/min培养3 5h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI =10 ,3 7℃温育15min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样5 0 μl测定上清中噬菌体滴度。结果 PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70nm ,无囊膜,有一个约60nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm ,圆形透明;当MOI为0 0 1时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线。结论 PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;最佳感染复数为0 0 1,感染宿主菌的潜伏期是2 0min ,爆发期是40min ,平均爆发量约为65。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法 电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果 噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论 PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3

布鲁菌噬菌体的生物学特性研究进展

布鲁菌属(Brucellae)细菌在核酸水平上非常相似,随着不同环境中布鲁菌新种及变异菌的出现,噬菌体分型实验在布鲁菌种的分型鉴定中依然发挥着不可替代的作用,本文从布鲁菌噬菌体的生长特征和宿主范围方面进行综述。

aFGF特异性结合噬菌体的筛选与鉴定

利用噬菌体7肽库筛选出aFGF特异性结合噬菌体并鉴定其活性.经过四轮淘选,ELISA检测结合活性,然后挑取单克隆测序.竞争抑制试验验证阳性克隆与aFGF的结合活性.MTT法检测阳性噬菌体对aFGF诱导的Balb/c3T3细胞增殖的影响.一系列实验结果显示,筛选出的P8号阳性噬菌体与aFGF结合的特异性很高,对aFGF诱导的Balb/c3T3细胞增殖具有抑制作用.通过本实验,获得了具有与aFGF高度结合的噬菌体短肽,可为抗肿瘤新药提供重要基础.

1株宽宿主谱大肠杆菌噬菌体的生物学特性观察

目的 观察 1株自污水中分离的宽宿主谱大肠杆菌噬菌体的生物学特性。方法 采用宿主范围测定、噬菌斑计数、负染色电镜观察、血清中和试验及血清交叉中和试验、一步生长实验等技术观察分离的噬菌体。结果 ①宽宿主谱大肠杆菌噬菌体可裂解五株大肠杆菌 ;②针对不同宿主菌其噬菌斑形态、大小、透明度、边缘界限、中心透明区及晕环均发生相应变化 ;③电镜超微结构显示此噬菌体为直径 2 0～ 40nm的微球形颗粒 ,棱角不明显 ,偶见短尾 ;④噬菌体的抗血清Κ值为 41 5 ,与f2 噬菌体血清学相关度为 0 .3 8;⑤潜伏期为 3 0～ 3 5min ,裂解量为 10 4。结论 分离所得的噬菌体是 1株大肠杆菌宽宿主谱噬菌体 ,为直径 2 0～ 40nm的圆形颗粒 ,其与f2 噬菌体的血清相关度较低 。

人源噬菌体抗体库的构建及抗VEGF抗体的初步筛选分析

应用噬菌体表面呈递技术构建人抗体组合文库 .筛选获得了结合血管内皮细胞生长因子( VEGF)的人噬菌体 Fab抗体 ,并对所获抗体的多样性进行了进一步分析 .从不同人群外周血淋巴细胞提取总 RNA,经反转录后采用家族特异性免疫球蛋白可变区基因引物与免疫球蛋白信肽序列引物 ,通过改变 PCR条件或半套式扩增分别获得全部亚型的轻、重链抗体 Fab段 ,并重组到噬粒载体 p Comb3H中 ,经电转化大肠杆菌 XL- 1 Blue,构建了 1 .5× 1 0 8完整组合抗体库 .利用 VEGF12 1对该库经过 4轮固相筛选后 ,获得 1 2个可与 VEGF特异结合的阳性克隆 .酶谱分析表明了所获抗体克隆的多样性 .为通过基因工程改造 ,进一步获得可用于临床的人源 VEGF抗体奠定了基础 .

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28000左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。