Cloning and Sequence Analysis of gyrB Gene of Fluoroquinolones-resistant Salmonella Isolated from Chickens

Nine strains resistant to five fluoroquinolones (Ciprofloxacin, Ofloxacin, Enrofloxacin, Danofloxacin, Sarafloxacin) were isolated from clinical samples and extracted the chromosomal DNA of these strains. Designed primers to amplify the Quinolone-resistance-determining region(QRDR) of gyrB gene, then the PCR products were cloned and the sequence was analyzed. In comparison with the standarded strain NCTC5776, no mutation was found in the QRDR of gyrB gene of all resistant strains. The result indicated that the QRDR of gyrB has little relationship with fluoroquinolone resistance to salmonella.

基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法

【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串联DNA特征序列的属内菌种鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。【方法】以2020—2021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种气单胞菌为研究对象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定。【结果】在基于16S rRNA序列构建的系统发育进化树中,中间气单胞菌、嗜水气单胞菌、达卡气单胞菌、肠源气单胞菌等聚类在不同分支上,未能形成独立的种属进化分支;在基于gyrB基因构建的系统发育进化树中,达卡气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌聚类在同一分支上,而异嗜糖气单胞菌和维氏气单胞菌聚类在另一分支上。将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树建树,能完全有效分离气单胞菌属的不同菌株,将不同种的气单胞菌独立聚为一支,较好地实现种间区分。【结论】将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树,较基于16S rRNA序列或gyrB基因单独构建系统发育进化树具有更高的分辨力,是一种理想的保守序列相似性高的属内菌种鉴定方法。因此,在16S rRNA测序鉴定为气单胞菌的情况下可再次以gyrB基因为测序对象,获得序列信息后与16S rRNA序列串联构建系统发育进化树,能更加精确地将气单胞菌鉴定到种水平。

利用16S rDNA结合gyrA和gyrB基因对生防芽孢杆菌R31的快速鉴定

克隆16S rDNA、DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA和B亚基编码基因gyrB对分离自石斛兰(Dendrobiumsp.)叶片的广谱抗真菌生防芽孢杆菌R31进行鉴定。首先通过生理生化测定和克隆16S rDNA序列,分析显示其属于芽孢杆菌属(Bacillus),但不能准确鉴定到种;然后分别利用克隆的gyrA基因和gyrB基因以及其BLAST分析结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。结果显示利用16S rDNA与gyrA基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌,利用16S rDNA与gyrB基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌及其近缘种。

霍乱弧菌和副溶血弧菌分离株的gyrB基因系统发育分析

依据gyrB基因部分编码序列构建系统发育树以分类和鉴别霍乱弧菌和副溶血弧菌,并探讨其种系发生关系。扩增并测序13株霍乱弧菌、8株副溶血弧菌、2株嗜水气单胞菌及1株类志贺邻单胞菌的gyrB基因(编码DNA促旋酶B亚单位)序列,并采用距离法与最大似然法构建系统发育树。两种方法所构建的树结构完全一致,霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌及类志贺邻单胞菌各自形成一个独立的簇。其中,霍乱肠毒素基因(ctxA)阳性的霍乱弧菌(8株O139群与2株O1群ElTor型)聚类成一分枝;3株副溶血弧菌临床株(1株2002年流行株,2株2004年分离株)与1日本菌株及2001年1株自环境分离的毒力株聚类。系统发育分析靶分子gyrB基因可以良好区分上述4种常见病原菌。产毒O139群霍乱弧菌与产毒O1群ElTor型霍乱弧菌关系密切。副溶血弧菌环境毒力株与本地区临床主要流行株在系统发育关系上较为接近,可能是潜在的致病菌。

gyrB基因在细菌分类和检测中的应用

gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因。综述了该基因近年来在细菌系统发育分析、细菌鉴定及临床医学应用的研究进展,并展望了其广阔的应用前景。

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

几种海藻表面附着细菌的分离及其gyrB基因序列分析

利用TCBS培养基从三种海藻:孔石莼(Ulva pertusa)、海带苗(Laminaria japonica)和多管藻(Polysiphonia urceolata)表面共分离得到10株细菌。生理生化试验和gyrB基因序列分析结果表明10株细菌都属于弧菌(Vibrio)。基于gyrB基因序列构建的系统发生树显示,菌株L5、L6、P7、P8、P10、P11、P12与Vibrio splendidus属于同一分支,序列间相似性为97.5-100%。菌株L4、P9与Vibrio cyclitrophicus属于同一分支,序列间完全一致。菌株U3在系统发生树上独立构成一个分支。本文结果表明不同海藻表面的附着细菌组成也不相同,具有一定的海藻特异性。

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据6株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的gyrB基因序列设计了1对特异性引物F1和R1,扩增产物大小为303 bp,以此引物对为基础,成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L-1(约为200个细菌/反应)的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法 .该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,它为今后从微生物群落结构复杂的环境中分离地衣芽孢杆菌奠定了良好的基础.

短乳杆菌gyrB基因的扩增与测序

目的:为检测短乳杆菌gyrB基因序列。方法:设计两对简并引物对3种啤酒污染乳酸杆菌进行PCR扩增,获得短乳杆菌部分目的基因片断。并将该片断克隆至pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶分析和测序获得短乳杆菌gyrB基因部分序列。结果:通过对序列进行进化树分析,发现该序列与啤酒典型污染菌植物乳酸杆菌gyrB序列相似性较高。结论:短乳杆菌gyrB序列对于建立啤酒中短乳杆菌快速检测具有十分重要的意义。

采用gyrB基因扩增快速鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究

目的:初步分析gyrB基因扩增用于结核分枝杆菌复合群(MTC)快速鉴定的可行性。方法:采用特异性引物进行分枝杆菌标准株和临床株的gyrB基因扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳观察聚合酶链反应(PCR)结果。结果:15株各种分枝杆菌标准株中,结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌均扩增出1184bp目的片段,而其余分枝杆菌PCR结果为阴性;94株分枝杆菌临床株中,60株MTB和10株牛分枝杆菌扩增阳性,而其他分枝杆菌(包括6株脓肿分枝杆菌、5株偶发分枝杆菌、4株龟分枝杆菌、3株鸟分枝杆菌、3株胞内分枝杆菌、2株耻垢分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌)均扩增阴性。结论:采用针对MTC的特异性引物进行gyrB基因扩增能快速、准确地鉴别MTC和非结核分枝杆菌。

嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)gyrB基因的PCR扩增、克隆与序列分析

根据GenBank和ICB数据库中gyrB蛋白氨基酸序列的两个保守区域TPGMYIG和QRY(F)KGLGEM设计简并引物,以L.ferriphilum菌株YSK基因组DNA为模板,PCR扩增出获得大小约为2.2kb的DNA片段。序列分析表明,菌株YSK的扩增片断的开放阅读框(ORF)能够推导出一个编码分子量约为82.24kD、氨基酸数目为731个的蛋白质片断。这个氨基酸序列与所研究的gyrB蛋白氨基酸序列显示出高度的同源性,尤其是与菌株AMC_Cont91的gyrB蛋白氨基酸序列的相似性高达92%,而与M.xanthus的gyrB的相似性最低,仅为37%。基于氨基酸序列的同源性及其所预测的蛋白质大小,可以推断出该扩增片段属于gyrB基因。

耐恩诺沙星沙门菌gyrA和gyrB基因的分子特征分析

为了探究临床分离的沙门菌对恩诺沙星的耐药机制,通过微量肉汤稀释法测定18株临床分离的沙门菌对恩诺沙星的敏感性,然后选取其中对恩诺沙星耐药的菌株,利用PCR扩增其gyrA和gyrB基因,并将扩增产物进行序列测定,最后用DNAMAN软件将测序结果与NCBI上公布的沙门菌标准野生型菌株(LT2)的gyrA和gyrB基因序列进行比对分析。结果显示,18株临床分离的沙门菌中有4株为耐药菌株,耐药率22.2%。对4株耐药菌株的gyrA和gyrB基因比对分析发现,gyrB基因未见突变,而gyrA基因有3个氨基酸位点突变,分别是Ser83→Phe或Leu(突变率100%)、Asp87→Asn(突变率75%)、Asn200→Asp(突变率25%);其中恩诺沙星最小抑菌浓度(MIC)≥16.000μg/mL的3株菌均是在83、87位出现双突变,而恩诺沙星MIC为4.000μg/mL的1株菌则是在83、200位出现双突变。结果表明,沙门菌对恩诺沙星产生耐药性与gyrA基因的突变密切相关,gyrA基因喹诺酮耐药区(QRDR)的双突变可使沙门菌对恩诺沙星的耐药性增强,提示Asp87的突变可能增强了Ser83位点突变所介导的耐药性,但非QRDR区的Asn200不能发挥增强耐药性的作用。

发光细菌PB-P3.9的鉴定与gyrB、luxA基因系统发育分析

平板划线分离法从猪肉上分离得到一株发光细菌PB-P3.9,依据细菌DNA促旋酶B亚基基因(gyrB)、荧光素酶A基因(luxA)序列比对及构建系统发育树鉴定其种属,并探讨其来源。扩增gyrB、luxA基因并测序,两个基因序列比对结果与发光杆菌属的明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)分别有99%、98%的序列相似性,结合其生物学特性,确定PB-P3.9为一株明亮发光杆菌。根据GenBank数据库中明亮发光杆菌标准菌株gyrB、luxA基因序列,采用距离法构建系统发育树,表明PB-P3.9株与标准菌株NCIMB 1279有最近亲缘关系,结合其生长条件,拟确定此发光细菌PB-P3.9来源于海洋深海鱼或中层海水浮游生物。

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据地衣芽孢杆菌的gyrB基因序列设计一对引物,扩增片段大小为507bp的基因片段,该方法对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,成功建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法,该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。

建立基于gyrB基因检测结核分枝杆菌复合物的荧光定量PCR法

目的建立基于gyrB基因扩增检测结核分枝杆菌复合物(MTC)的荧光定量PCR(FQ-PCR)法。方法根据gyrB基因设计合成引物和探针,建立并评价TaqMan探针FQ-PCR法,并与基于IS6110序列的FQ-PCR法分别检测50例临床标本,比较两种方法的检测结果。结果建立的FQ-PCR法标准曲线方程为Y=-3.18X+42.84,相关系数(r2)为0.995、扩增效率为106.25%,其检测灵敏度为102CFU/mL;MTC中结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌阳性,其他分枝杆菌和4株临床其他细菌均为阴性。批内及批间变异系数(CV)均<2%,重复性良好。本法与基于IS6110序列的FQ-PCR法对50例临床标本的检测结果差异无统计学意义(χ2=0.06,P>0.05),一致性好(κ=0.94)。结论基于gyrB基因扩增的FQ-PCR法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于结核分枝杆菌复合物的早期快速诊断。

基于LAMP技术针对溶藻弧菌gyrB基因快速检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立针对溶藻弧菌gyrB基因的快速检测方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC-17749)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过在线生物学软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计针对溶藻弧菌gyrB基因的LAMP引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快速检测方法。结果①经2g/dl凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min和90 min凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min能满足扩增需要;③利用同一体系对临床6种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀释法验证该LAMP体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论建立了基于LAMP技术针对溶藻弧菌gyrB基因的快速检测方法,具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。

鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性分析

【目的】分离鉴定鲤(Cyprinus carpio)致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),为探究暴发病害养殖鲤的死亡原因及为防治水产经济鱼类病害提供参考依据。【方法】从暴发病害鲤的内脏组织中分离病原菌,通过形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA和gyrB基因测序分析确定其分类地位,通过人工回归感染试验判断其致病性,通过药物敏感性试验判定其对抗生素的耐药性。【结果】细菌形态学观察和生理生化试验结果表明,从暴发病害鲤的内脏中分离的病原菌LY623为维氏气单胞菌。16S rDNA和gyrB基因测序结果显示,LY623菌株与维氏气单胞菌菌株的相似性最高,且在系统发育进化树中与维氏气单胞菌聚为一支。毒力基因和耐药基因检测结果表明,菌株LY623携带Alt、Act、hlyA、lip和ela 5种毒力基因及tem、ctxM、tetC、qnrA和qnrS 5种耐药基因。药敏试验结果表明,LY623菌株对四环素、诺氟沙星和红霉素等14种抗菌药物具有耐药性,对庆大霉素、氟苯尼考和氯霉素等14种抗菌药物高度敏感。人工回归感染试验结果表明,分离获得的维氏气单胞菌LY623对鲤的半数致死量(LD50)为2.64×10^(3)CFU/g,对斑马鱼(Danio rerio)的LD_(50)为4.77×10^(7)CFU/g。【结论】从暴发病害鲤内脏组织中分离到的病原菌LY623鉴定为维氏气单胞菌,其毒力基因包括Alt、Act、hlyA、lip和ela,耐药基因包括tem、ctxM、tetC、qnrA和qnrS。该菌株对鲤具有较高毒力,在其肠道、鳃、肝脏和脾脏中引起明显的组织病理学变化;在鲤实际养殖过程中可选用庆大霉素、氟苯尼考和氯霉素等对该菌感染引起的疾病进行治疗。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。

海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究

2014年3—5月海南省罗非鱼主养区多个养殖场发生爆发性疾病,从患病尼罗罗非鱼不同组织中分离获得12株优势菌。经人工回归感染试验,从肝脏和脑中分离获得的HN-G-03和HN-B-02菌株具较强的致病力,HN-G-03和HN-B-02菌株对罗非鱼的的半致死密度分别为7.12×105cfu/尾和1.32×105cfu/尾。经16S rRNA和gyr B基因序列分析,同时结合细菌的形态学特征、生理生化特征,菌株HN-G-03和HN-B-02分别被鉴定为维氏气单胞菌的维氏生物型和温和生物型。体外药物药敏试验结果显示,两株菌均对左氧氟沙星、强力霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、庆大霉素等5种药物高度敏感,对呋喃妥因等3种药物中度敏感,对青霉素等12种药物较强耐药。

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。