结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答

目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。

结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞的研究

目的:研究结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后氮氧化物的产生及细胞因子的分泌和表达情况。方法:结核杆菌H37Ra感染RAW264.7巨噬细胞株24 h后收集上清液,用Griess法检测一氧化氮(NO),化学法检测过氧化氢(H2O2)的产生,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测感染后巨噬细胞IL-12和TNF-αmRNA的表达,ELISA法检测细胞因子IL-12和TNF-α的含量。结果:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后产生的NO和H2O2水平均显著升高,同时IL-12和TNF-α的分泌和表达也明显增加(P<0.05)。结论:结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞后能产生大量的氮氧化物和抗结核细胞因子,从而产生有利于宿主的抗结核免疫应答。

结核菌H37Ra免疫小鼠后机体抗结核细胞免疫功能的研究

目的探讨小鼠皮内接种H37Ra后,细菌在体内的定植及机体能否产生针对结核菌的免疫力。方法用H37Ra皮内免疫小鼠后15、30、60 d,检测结核菌在小鼠体内脏器的定植;免疫后第30、60天,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的增殖转化刺激指数、ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后IL-2、sIL-2R的表达量。结果小鼠脾、肺脏中有结核菌定植,并至少存活60 d;脾淋巴细胞30、60 d的刺激指数分别为(2.81±0.63)、(2.16±0.52),与BCG皮内接种组无显著性差异,与未免疫组有显著性差异(P<0.05);脾淋巴细胞IL-2、sIL-2R表达量分别为(126.88±8.11)、(91.26±7.29)pg/m l和(138.58±7.67)、(127.09±5.47)pg/m l,与BCG皮内接种组、未免疫组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗结核免疫力,且免疫效果略优于BCG。

结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究

目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。

结核菌H37Ra免疫小鼠后PPD刺激淋巴细胞增殖转化的探讨

目的探讨小鼠接种H37Ra后,PPD刺激鼠淋巴细胞的增殖转化情况。方法用H37Ra皮内、腹腔免疫小鼠后30、60天,检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的转化率。结果小鼠接种H37Ra后,30天淋转率分别为21.98%(腹腔)和24.85%(皮内);60天淋转率分别为25.50%(腹腔)和25.02%(皮内),明显高于未免疫组(P<0.01);与BCG皮内免疫组比较,无显著性差异(P>0.05);H37Ra腹腔和皮内不同途径接种,淋巴细胞转化率无明显差异。结论H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生抗结核的免疫应答。

热杀死结核分支杆菌H37Ra诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型研究

目的对热杀死结核分支杆菌H37Ra(Mtb)诱导SD大鼠关节炎模型的血液学、T细胞功能、关节滑膜细胞凋亡及病理变化进行分析,以评价该模型与临床RA类疾病的相似性。方法 SD大鼠尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期检测大鼠外周血液常规、血液流变学改变;采用流式细胞术测定外周血淋巴细胞凋亡率及调节性T细胞比例;TUNEL法检测关节滑膜细胞凋亡,镜下观察关节滑膜病理改变。结果 SD大鼠经Mtb免疫后,外周血血红蛋白含量下降,血小板总数、红细胞压积上升,全血黏度、血浆黏度上升;外周血淋巴细胞凋亡率明显降低;CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T细胞的比例、CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例均下降;关节滑膜细胞凋亡减少;关节滑膜组织异常增生,有大量炎性细胞浸润,并有肉芽组织形成。结论由Mtb诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型临床表现及组织学改变与临床RA相似,免疫学指标存在明显的细胞免疫异常;该模型制作方法简单、复制成功率高、经济实用,可广泛用于RA的医学研究及抗RA新药筛选。

活菌H37Ra与灭活菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的实验研究

目的:探讨小鼠腹腔接种结核分枝杆菌活菌H37Ra、灭活菌H37Rv后,诱导巨噬细胞免疫物质的表达差异,探讨活菌H37Ra及灭活菌H37Rv作为新的结核候选疫苗的可行性。方法:分别培养BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞,用活菌H37Ra,灭活菌H37Rv感染10小时后用抗酸染色方法,观察各组巨噬细胞吞噬情况并计算吞噬率。将活菌H37Ra、灭活菌H37Rv、生理盐水分别接种BALB/c小鼠腹腔,免疫30天后取小鼠腹腔巨噬细胞,RT-PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的基因转录水平;ELISA法检测细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-的表达;Griess法、化学法检测小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、H2O2水平;流式细胞仪检测IFNγ-诱导的CD40L的变化情况。结果:巨噬细胞对活菌H37Ra和灭活菌H37Rv的吞噬率分别为(55.71±8.42)%、(14.82±2.12)%。与灭活菌相比,活菌H37Ra有更强的被吞噬能力(P<0.01)。活菌H37Ra免疫小鼠腹腔巨噬细胞后能显著诱导巨噬细胞的IL-12P40、TNF及IFNγ-基因的转录;细胞因子IL-12P40、TNFα-、IFNγ-、NO及H2O2高水平分泌;同时活菌H37Ra刺激IFNγ-诱导的巨噬细胞表面CD40L的高表达。结论:活的结核分枝杆菌H37Ra能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生更多的保护性免疫物质,有利于免疫应答,有可能作为新的结核候选疫苗,而灭活菌H37Rv不能显著激活小鼠腹腔巨噬细胞分泌保护性免疫物质,不宜作为新的结核候选疫苗。

结核菌H37Ra免疫小鼠后巨噬细胞TNF-α表达的初步探讨

目的:探讨小鼠接种结核菌H37Ra株后,巨噬细胞表达TNF -α的活性情况。方法:H37Ra皮内、腹腔途径免疫小鼠后第30、6 0天,采用生物学活性方法检测小鼠腹腔巨噬细胞表达的TNF -α活性。结果:小鼠接种H37Ra后,30天时TNF-α活性分别为2 2 .0 6U/ml(腹腔)和2 2 .6 3U/ml(皮内) ;6 0天时TNF -α的活性分别为36 .76U/ml(腹腔)和33.78U/ml(皮内) ,明显高于未免疫组(P <0 .0 1) ;与BCG皮内免疫组比较,30天时无显著性差异(P >0 .0 5 ) ,6 0天时有明显差异(P <0 .0 5 )。结论:H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生TNF -α。

结核菌H37Ra皮内接种对小鼠巨噬细胞的激活效应

目的探讨小鼠皮内接种结核菌H37Ra后,腹腔MΦ是否被免疫激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,从而了解H37Ra的免疫应答过程及对MΦ的抗菌免疫作用。方法用H37Ra、BCG皮内免疫小鼠后第30、60天,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔MΦ在受到、未受到IFN-γ刺激后NO、H2O2的产生以及IL-12、TNF-α的表达水平。结果①H37Ra免疫小鼠后能显著诱导MΦ分泌表达IL-12、TNF-α,与BCG皮内接种组、未免疫组比较,其差异均有统计学意义(P<0.05);也能诱导MΦ产生NO、H2O2,与未免疫组比较具有统计学意义(P<0.05),与BCG皮内接种组比较,无明显差异;②IFN-γ对巨噬细胞氮氧化物的产生、细胞因子的表达具增强效应。结论H37Ra皮内接种小鼠后能诱导巨噬细胞活化并产生较强的激活效应,且该效应略优于BCG。

结核分枝杆菌H37Ra免疫小鼠后细菌在体内定植的研究

目的:了解H37Ra(人型结核分枝杆菌标准无毒株)免疫小鼠后在体内生长情况。方法:将H37Ra和BCG分别皮内接种C57BL/6小鼠,免疫后15天、30天及60天,取稀释小鼠脾脏和肺脏匀浆接种罗氏培养基,培养18天后计菌落数(CFU)。结果:免疫后15天、30天及60天,H37Ra在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU为1.95、1.57、2.54和1.37、1.08及0.94;BCG在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU则为1.72、1.39、1.06和1.16、0.96及0.50。免疫后15天及30天,脾脏及肺脏定植的H37Ra和BCG无显著性差异(P>0.05);免疫后60天,脾脏及肺脏定植的H37Ra显著多于BCG(P<0.05)。H37Ra和BCG在脾脏定植的细菌数显著多于肺脏(P<0.05)。结论:H37Ra在C57BL/6小鼠体内至少可以存活2个月。

结核菌H37Ra和BCG感染巨噬细胞的实验研究

目的:探讨H37Ra和BCG诱导巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的能力,细菌在巨噬细胞内生存和破坏巨噬细胞的能力。方法:H37Ra和BCG分别感染BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞株及THP-1细胞株,24 h后取培养上清液,Griess法检测NO的释放量;分别于感染后的0、4 d及7 d用1%Triton X-100裂解巨噬细胞后接种罗氏培养基,培养18 d后计数菌落形成单位(CFU);同时于每个时间点,用MTT法检测巨噬细胞存活率的变化。结果:H37Ra和BCG均可诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞株及THP-1细胞株产生多量的NO,两组均显著高于对照组(P<0.05);H37Ra感染组稍高于BCG感染组,但差异无统计学意义(P>0.05);H37Ra和BCG均可在巨噬细胞内生存繁殖,H37Ra或BCG的感染均降低巨噬细胞的存活率,随着感染时间的延长细菌破坏巨噬细胞的效果越来越显著。结论:H37Ra和BCG均可增强巨噬细胞的抗微生物活性,它们对巨噬细胞均具有一定的毒力;H37Ra的毒力低于BCG。

结核分枝杆菌H37Ra抗结核作用相关研究进展

结核分枝杆菌H37Ra菌株(H37Ra)是人型结核分枝杆菌减毒株,它毒力极弱,对宿主相对安全,具备活菌疫苗的条件。与卡介苗(BCG)相比H37Ra菌株具有更完整的免疫原性,并包含一些BCG中丢失的抗原性成分。同时,H37Ra菌株能够充分活化巨噬细胞,刺激机体产生特异性免疫应答,在防治结核病中起到重要作用。因此,H37Ra菌株对机体抗结核的保护作用是否强于BCG,是否能作为抗结核的候选活疫苗已受到学者的关注,为今后研制新型、安全、高效的结核病苗奠定基础。本文对H37Ra菌株抗结核的相关研究进行了综述。

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的抗结核细胞免疫应答的研究

目的:研究结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫应答及其对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)毒株感染的保护力。方法:Balb/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,皮内免疫8周后处死小鼠,流式细胞分析仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的变化;取小鼠脾淋巴细胞体外培养并用PPD刺激,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数(SI);ELISA法检测培养上清液中IFN-γ;免疫后第8周,用MTB毒株H37Rv经小鼠腹腔注射,4周后处死小鼠,测定小鼠肺脏荷菌量,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用。结果:H37Ra免疫小鼠脾脏CD3^+T细胞、CD4^+T细胞的百分率分别为(41.63±1.68)%、(27.08±0.58)%,显著高于NS对照组(38.34±0.74)%、(24.37±1.60)%(P<0.05)。H37Ra免疫组脾脏CD3^+T细胞、CD4^+T细胞及CD8^+T细胞的百分率均不同程度地高于BCG免疫组,但差异无统计学意义。脾淋巴细胞SI和IFN-γ水平检测均发现H37Ra免疫组显著高于NS对照组(P<0.05),略高于BCG免疫组。感染4周后H37Ra组小鼠肺脏荷菌量与NS对照组比较下降0.954log_(10)CFU,差异有显著性(P<0.05),与BCG组之间差异均无显著性(P>0.05)。结论:H37Ra免疫小鼠后可以诱导产生特异性抗结核的细胞免疫应答,能够抵抗毒株H37Rv的攻击,且免疫效果与BCG相近。

人型结核分枝杆菌H37Ra在构建实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型中的应用

目的探讨人型结核分枝杆菌H37Ra在以鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段(R97-116)为免疫原构建重症肌无力动物模型实验中的作用。方法以R97-116为免疫原于Lewis大鼠皮下及足垫进行皮下接种,以是否添加H37Ra为条件将20只动物分为实验组和对照组,同时设置空白对照组(10只)。比较各组间行为学、体重及乙酰胆碱受体抗体滴度差异。结果实验组动物局部炎性反应明显,3只动物死亡,6只出现无力症状,1只未出现明显异常表现,6只有无力症状大鼠抗体均呈阳性。对照组大鼠接种处也有局部炎性反应,仅有2只出现轻度无力症状,其中1只抗体可疑阳性,另1只阴性。实验组大鼠体重[(190. 21±8. 35) g]明显低于对照组[(243. 22±7. 98) g]和空白对照组[(251. 22±5. 81) g],差异有统计学意义(P <0. 05),对照组和空白对照组差异无统计学意义。结论 H37Ra为本实验成功的必要试剂。

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:研究结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性免疫应答以及保护效果。方法:BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,免疫8周后处死部分小鼠,取脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4水平。另一部分免疫小鼠经腹腔感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuber-culosis,MTB)毒株H37Rv,4周后处死,测定小鼠脏器重量指数。取稀释的小鼠脾脏和肺脏匀浆接种于改良罗氏培养基,培养21天后计数脏器荷菌量。结果:H37Ra和BCG免疫小鼠脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组。感染4周后H37Ra和BCG组小鼠脏器重量指数较NS对照组均显著降低。H37Ra组小鼠脾脏和肺脏荷菌量与NS对照组比较分别下降了1.228log10CFU和0.954log10CFU,差异有显著性(P<0.05),与BCG组之间差异均无显著性。结论:H37Ra免疫小鼠后可以诱导产生Th1型免疫应答,能够抵抗毒株H37Rv的攻击,且免疫效果与BCG相当。

结核菌H37Ra诱导迟发型超敏反应的探讨

[目的]探讨结核分枝杆菌H37Ra免疫小鼠后能否诱发迟发型超敏反应及最佳的观测时间。[方法]Balb/c小鼠随机分为3组。分别用H37Ra、BCG和NS皮内免疫,6周后每组小鼠皮内注射PPD,游标卡尺测定24、48和72h局部皮肤红肿、硬结直径。[结果]H37Ra组24、48和72h的局部皮肤红肿、硬结直径结果分别是(6.17±0.20)、(5.23±0.35)、(3.59±0.40)mm,24和48h反应稍弱于BCG组[(6.71±0.66)、(5.89±0.52)mm],无统计学意义(P﹥0.05)。与NS对照组相比,H37Ra和BCG免疫小鼠后均能诱导显著的迟发超敏型反应(P﹤0.05)。H37Ra组和BCG组均24h反应最明显。[结论]结核分枝杆菌H37Ra免疫小鼠6周后能诱导迟发型超敏反应,较BCG弱;24h为最佳观测时间。

人型结核杆菌H37Ra的抗原决定簇的筛选及其初步鉴定

本文报道一种筛选人型结核杆菌H37Ra的抗原决定簇的Western Blot分析技术。细菌培养滤液经15％SDS—PAGE电泳进行分离,然后电转移到硝酸纤维素薄膜上,应用鼠抗人结核杆菌单克隆抗体进行免疫反应。通过免疫印染,一条能与McAb起强阳性反应的蛋白带被识别。应用蛋白质洗脱技术,这个蛋白质片段被提纯。经SDS—PAGE电泳分析,这个含有抗原决定簇的蛋白质片段为分子量17,500道尔顿,斑点免疫试验证实该片段具有生物学活性。本文提示,Western Blot分析技术是对抗原决定簇进行分析的有用方法,值得推荐。

卡介苗菌株和结核分枝杆菌H37Ra菌株原生质体的制备研究

分别以卡介苗菌株(BCG)及结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(H37Ra)为受体菌,制备上述两种菌株的原生质体,同时通过优化细菌菌龄、酶解浓度、酶解温度以及酶解时间等影响因素,探索出制备原生质体形成及再生的最优条件。结果显示:摸索出制备BCG和H37Ra菌株的原生质体条件:在对数生长期的两亲本菌株,经0.01 mol/L EDTA,0.01%β-巯基乙醇溶液预处理;酶解浓度为12 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间为5 h,可制备出活性较高的两种菌株的原生质体。由此可知,成功制备了BCG与H37Ra菌株的原生质体,并能在高渗固体培养基上再生。本实验为进一步研究该两种菌株原生质体融合试验奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

结核分枝杆菌H37Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。