含人自噬基因hAPG12穿梭载体构建及其在酵母自噬中的作用

目的该研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,将构建好的载体转化到酵母菌内,以此研究hAPG12在酵母自噬过程中的作用。方法从pEGFP-C2-hAPG12中扩增出EGFP-hAPG12融合基因,鉴定正确后定向亚克隆到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pESC-URA中,构建载体pESC-URA-EGFP-hAPG12并将其转化到酵母,荧光显微镜下观察,用自噬诱导剂诱导酵母自噬以观察hAPG12在酵母内的表达定位。结果证实EGFP-hAPG12基因已完全正确亚克隆到pESC-URA中,荧光显微镜观察结果证明EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中成功表达,以诱导培养24h的荧光最强,EGFP-hAPG12定位于酵母的自噬体中。结论成功构建了具有报告基因的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12;EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中得到表达,hAPG12在酵母自噬体形成过程中起作用。

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。