氧化应激诱导自噬抑制人骨髓间充质干细胞(hBMSC)增殖和凋亡

目的探讨H_(2)O_(2)诱导氧化应激反应对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)自噬和凋亡的影响。方法分离培养hBMSC,分为空白组(只加培养基)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理组、H_(2)O_(2)处理组、H_(2)O_(2)联合3-MA处理组。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色检测hBMSC活性氧(ROS)水平,CCK-8法检测(0、50、100、200、400)μmol/L H_(2)O_(2)对hBMSC增殖的影响;单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光胺基探针染色、溶酶体荧光探针LysoTracker Red染色观察细胞自噬水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞beclin 1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3蛋白表达。结果与空白组、3-MA预处理组比较,H_(2)O_(2)处理组细胞内ROS水平升高、细胞自噬体增加,细胞增殖和凋亡率显著降低;beclin 1、mTOR、c-caspase-3蛋白表达上调,p-mTOR蛋白表达下调。与3-MA处理组比较,H_(2)O_(2)联合3-MA处理组细胞内ROS水平升高、细胞自噬体增加,细胞凋亡率升高不明显;beclin 1、mTOR、c-caspase-3蛋白表达上调,p-mTOR蛋白表达下调。结论H_(2)O_(2)可诱导hBMSC产生氧化应激,hBMSC自噬增强,细胞增殖和凋亡降低。

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β3和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞。方法取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40mL分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs行三维微球培养。根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10ng/mLTGF-β3组(A组)、200ng/mLBMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组)。于培养后21d,行组织学及免疫组织化学观察;于培养后4、21d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达。结果培养后21d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性。B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4d时明显增加(P<0.05)。B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P<0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型胶原较4d时无明显变化(P>0.05)。其中仅A组Ⅹ型胶原表达呈阳性。结论TGF-β3和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞。

利用hBMSCs在生物反应器中构建小口径血管的实验研究

目的采用改进的生物反应器系统,应用人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)构建小口径的组织工程血管。方法设计一套血管生物反应器系统,采用有限元方法对组织工程小血管托架材料进行分析,从而设计一套用于构建直径为2mm的小血管托架;收集人的原代骨髓基质干细胞进行体外扩增和培养,选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯(PGA)复合后置于血管生物反应器中动态培养;培养4周后,对材料复合物取材,进行大体观察、HE染色、扫描电镜和平滑肌免疫组化等指标检测。结果血管色泽明亮,有一定的弹性,用镊子反复压下血管能够反弹恢复原样;细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组化结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分。结论改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用hBMSCs成功构建组织工程化小血管组织。

静电纺SF/CS复合纤维支架对hBMSCs体外细胞增殖及成骨分化的影响

目的:用静电纺丝法制备丝素(SF)/壳聚糖(CS)纳米纤维膜支架,评价其性能及对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:将SF、CS以质量比1∶0和1∶1共同溶于三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中,采用静电纺丝法制备SF电纺膜支架和SF/CS电纺膜支架。通过扫描电子显微镜(SEM)、红外光谱(FTIR)、热重分析(TG/DTG)等对电纺膜的结构性能进行表征。hBMSCs分别接种于SF、SF/CS支架表面(对照组直接接种于培养皿),进行成骨诱导培养,CCK-8实验研究hBMSCs生长增殖情况,能谱仪(EDS)、茜素红染色(ARS)检测各组hBMSCs成骨矿化能力。结果:SEM和FTIR结果显示,与SF支架比较,SF/CS支架纤维直径更为均一,构象更为稳定;而TG/DTG结果显示,SF组热稳定性更佳;与对照组比较,SF组和SF/CS组hBMSCs增殖能力无显著差异(P>0.05);培养21d后,元素分析表明SF/CS组钙元素含量更高;与对照组及SF组相比,SF/CS组hBMSCs钙化结节明显增多且染色较深。结论:静电纺SF/CS纳米纤维支架生物相容性佳,对hBMSCs成骨分化有促进作用。

体外共培养hBMSCs和HUVECs对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:利用三维共培养技术体外构建含多种细胞的胰腺癌微组织,研究骨髓间充质干细胞(hBMSCs)、内皮细胞(HUVECs)对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响。方法:水凝胶复合细胞培养构建三维胰腺癌微组织模型。第一组:单纯Panc-1细胞;第二组:Panc-1细胞复合HUVECs;第三组:Panc-1细胞复合hBMSCs;第四组:Panc-1细胞复合HUVECs和hBMSCs。实时定量PCR分析胰腺癌肿瘤侵袭相关的基质金属蛋白酶(MMP-9)、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail基因。Western blot测定胰腺癌肿瘤侵袭相关的MMP-9、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail蛋白。结果:HUVECs共培养不影响MMP-9、E-cadherin和Snail基因和蛋白的表达(P>0.05),hBMSCs共培养促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05),同时加入两种细胞促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05)。结论:利用水凝胶为载体,加入骨髓间充质干细胞、内皮细胞与Panc-1胰腺癌细胞共培养,成功构建复杂的胰腺癌肿瘤微组织。通过对胰腺癌上皮间质转化相关机制研究,发现骨髓间充质干细胞通过调节MMP-9和上皮间质化对胰腺癌的侵袭行为起重要作用。

Wnt/β-catenin信号通路在低氧促进hBMSCs体外增殖中的作用

目的探讨持续低氧环境对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMSCs)体外增殖的影响,并初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在其中的作用。方法将购自江阴齐氏生物科技有限公司第2代h BMSCs进行传代、纯化,取第4代h BMSCs进行流式细胞仪检测鉴定;根据培养条件不同分为常氧组(20%氧浓度)和低氧组(3%氧浓度);CCK-8法测定各组生长曲线;采用RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路关键组件β-catenin、cyclin D1 m RNA表达水平;Western blot检测β-catenin、P-β-catenin蛋白表达水平。结果第4代h BMSCs流式鉴定结果显示:骨髓基质标志CD90表达为98.7%,而造血细胞标志CD19表达为0.3%;与常氧组比较,低氧组增殖速率更快,β-catenin、cyclin D1 m RNA表达升高(P<0.05),β-catenin蛋白表达升高(P<0.05),P-β-catenin蛋白表达下降(P<0.05)。结论持续低氧环境可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路而促进h BMSCs体外增殖。

补肾舒脊颗粒对hBMSC软骨内成骨过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨补肾舒脊颗粒对hBMSC软骨内成骨过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用。方法:原代hBMSC传至第3代后分为5组:补肾舒脊颗粒高、中、低剂量组,西药组,空白对照组,进行软骨细胞诱导分化,运用ELISA法检测细胞上清液中DKK-1表达,Western Blot和荧光定量PCR检测SOST、Wnt5a和β-catenin蛋白和基因表达。结果:与空白对照组比较,中药中、高剂量组DKK-1、SOST蛋白水平显著增高(P<0.05,P<0.01);与西药组比较,中药中、高剂量β-catenin蛋白降低(P<0.05)。与空白对照组比较,中药低、中、高剂量组及西药组SOST mRNA水平升高(P<0.05),中药中、高剂量组及西药组Wnt5a mRNA水平下降(P<0.05),中药低、中、高剂量组β-catenin mRNA水平下降(P<0.05);与西药组比较,中药高剂量组SOST mRNA水平升高(P<0.05),β-catenin mRNA水平降低(P<0.05)。结论:补肾舒脊颗粒可能能够抑制hBMSC软骨内成骨过程中的Wnt/β-catenin信号通路。

全骨髓培养法和密度梯度离心法分离hBMSCs的比较研究

目的比较全骨髓培养法和密度梯度离心法对hBMSCs的分离效果。方法取健康成年人自愿捐赠的骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法分离、培养hBMSCs并进行传代。采用倒置相差显微镜观察原代细胞形态变化;取第2代细胞培养7d后行HE染色;对比原代及第2、3代细胞传代时间;流式细胞仪检测表面标志物;并检测细胞经成骨诱导后3、6、9d的ALP含量,于第9天采用Kaplow法染色观察细胞ALP染色情况。结果全骨髓培养法分离的原代细胞呈聚集样生长,而密度梯度离心法分离的原代细胞呈单个、散在生长。HE染色示两种方法分离培养的第2代细胞轮廓清晰,大小及形态均匀一致。全骨髓培养法原代细胞的传代时间(15.36±1.67)d;明显快于密度梯度离心法的(18.57±1.05)d,差异有统计学意义(P<0.01);第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义(P>0.05)。经流式细胞仪检测,两种方法培养的hBMSCs上阳性表面标志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166含量和阴性表面标志物CD34含量比较差异无统计学意义(P>0.05),阴性表面标志物CD14、CD45含量差异有统计学意义(P<0.01)。两种方法分离的第2代细胞经成骨诱导后各时间点ALP含量比较差异无统计学意义(P>0.05);成骨诱导后第9天ALP染色程度基本一致。结论全骨髓培养法可分离出hBMSCs,其分离效果与密度梯度离心法相似。

缺氧对hBMSCs和胎盘来源MSCs增殖的影响

目的比较hBMSCs和人胎盘基蜕膜MSCs(human placental decidua basalis-MSCs,hPDB-MSCs)在化学缺氧条件下的增殖情况,为寻找组织工程新的种子细胞提供理论依据。方法采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs与hPDB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物;CoCl2建立化学缺氧模型,MTT法检测两种细胞在不同CoC12浓度(0、50、75、100、125、150、175、200μmol/L)和不同时间(6、12、24、48、72和96 h)的增殖情况。结果流式细胞仪检测显示hPDB-MSCs与hBMSCs均表达CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人类白细胞抗原ABC(human leucocyte antigen ABC,HLA-ABC),不表达CD34、CD40L和HLA-DR;但与hBMSCs相比,hPDB-MSCs阶段特异表达的胚胎抗原1(stage-specifi c embryonic antigen 1,SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(tumor rejection autigen,TRA)-1-60、TRA-1-81表达更高。化学缺氧12 h内,hBMSCs与hPDB-MSCs增殖均被抑制,12 h后均能促进增殖;与对照组比较,hBMSCs经150μmol/L CoCl2作用24 h出现显著增殖(P<0.05),hPDB-MSCs在75μmol/L CoCl2作用12 h后出现显著增殖(P<0.05)。结论与hBMSCs相比,hPDB-MSCs表达更高的胚胎干细胞特有表面抗原,同时对化学缺氧所致的增殖影响更为敏感,可能成为一种新的组织工程种子细胞来源。

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制。方法采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养。于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factorα1,Cbfα1)、ALP、ColⅠ、OCN mRNA的表达。结果诱导培养7 d,ALP染色结果显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性。B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度。B、E、F组细胞培养7 d,F组Cbfα1、ALP、ColⅠ、OCN mRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组。结论LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达。

腺病毒介导的生长分化因子5基因对hBMSCs成骨分化的影响

目的利用重组腺病毒载体将生长分化因子5(growth and differentiation factor5,GDF-5)基因导入hBMSCs,研究GDF-5基因的表达和对hBMSCs成骨分化的影响。方法将重组腺病毒GDF-5(adenovirus GDF-5,Ad-GDF-5)[含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记]和空载腺病毒Ad-GFP进行扩增并测定滴度,并以不同滴度两种病毒感染第3代hBMSCs,干预后2d荧光显微镜下观察GFP表达情况,RT-PCR检测GDF-5在hBMSCs中的表达。取第3代贴壁hBMSCs随机分为4组:实验组(GDF-5基因转染组)、成骨诱导组、空载组和对照组。于干预后不同时间行倒置相差显微镜观察、荧光显微镜观察、荧光定量RT-PCR、免疫荧光染色和vonKossa染色检测细胞分化情况。结果Ad-GDF-5滴度为1.0×109pfu/mL,Ad-GFP滴度为1.2×109pfu/mL。Ad-GDF-5及Ad-GFP均能对hBMSCs有效感染,并使其表达目的基因和GFP基因。干预后1～7d实验组和成骨诱导组hBMSCs细胞形态及生长方式向成骨细胞转化,而对照组和空载组hBMSCs仍保持原有形态及生长方式。荧光定量RT-PCR检测示,干预后4d实验组GDF-5基因表达明显高于其余各组(P<0.05);实验组和成骨诱导组ALP、ColⅠ、骨钙素基因表达均高于空载组和对照组(P<0.05),成骨诱导组ColⅠ基因表达高于实验组(P<0.05)。干预后4d,免疫荧光染色示成骨诱导组和实验组细胞表达并分泌ColⅠ,空载组和对照组细胞未见ColⅠ表达。干预后10d,成骨诱导组和实验组细胞vonKossa染色为阳性,对照组和空载组为阴性。结论GDF-5基因可通过腺病毒载体导入hBMSCs稳定表达,并促使其成骨分化,为进一步研究这种转基因hBMSCs修复骨组织奠定了基础。

hBMSCs的生物打印初步研究

目的初步确立hBMSCs的二维生物打印方法,实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后细胞活力。方法取健康志愿者骨髓5mL,常规培养hBMSCs至第2代,调整为1×106个/mL单细胞悬液。实验分3组:打印组1细胞先行碘化丙啶(propidium iodide,PI)荧光标记,快速成型组织打印机进行二维细胞打印,x轴间隔300μm,y轴间隔1500μm,激光共聚焦显微镜观察。打印组2细胞未行PI标记,经生物打印后培养2h,Live/Dead viability Kit测定细胞活力,激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况;取1份未经Live/Dead viability Kit测试的打印组2细胞,培养7d后倒置显微镜观察细胞形态,贴壁后常规培养,动态观察细胞生长状态。对照组除细胞悬液不行打印,其余操作同打印组2。结果打印组1细胞激光共聚焦显微镜观察,"细胞墨滴"在二维组织中规则且均匀分布,满足二维设计细胞打印要求;每个"细胞墨滴"包含细胞15～35个。打印组2细胞经活力测试,细胞孵育30min后激光共聚焦显微镜观察显示细胞荧光染色情况。对照组细胞活力与打印组2无明显区别。打印后细胞常规培养7d,细胞可正常贴壁生长,形态、生长状态良好。结论通过生物打印技术可实现hBMSCs在二维平面上的定向、定量规则分布,并为进一步的细胞三维打印乃至器官打印体系奠定基础。

诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。

脂质体介导的重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF_(165)体外转染对hBMSCs成骨能力的影响

目的探讨重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165体外转染对hBMSCs成骨诱导分化的影响。方法构建hBMP-2和hVEGF165真核共表达载体。取健康成人自愿捐献的骨髓分离培养hBMSCs,采用阳离子脂质体将构建的质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165和空质粒载体(pIRES-neo)转染至hBMSCs,作为A、B、C、D组;另取相同数量的未转染细胞作为对照组(E组)。培养4周,采用RT-PCR检测hBMP-2、hVEGF165以及骨钙mRNA表达,Western blot检测细胞hBMP-2和hVEGF165表达,定量检测ALP活性,免疫组织化学方法检测ColⅠ表达。结果与E组比较,A组hBMSCs高表达hBMP-2、hVEGF165、ColⅠ及骨钙素,B组大量表达骨钙素及ColⅠ,C组高表达hVEGF165,而B组hVEGF165及C组hBMP-2和ColⅠ的表达与D、E组相似,呈阴性或仅有痕量表达。A、B、C、D及E组ALP活性分别为0.91±0.03、0.90±0.02、0.64±0.03、0.67±0.01、0.66±0.02,A、B组与E组比较差异有统计学意义(P<0.05),C、D、E组差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组质粒通过阳离子脂质体能成功转染hBMSCs,外源性hBMP-2和hVEGF165基因在转染细胞中能持续表达,并能增强hBMSCs的成骨能力。

不同接种方法下hBMSCs在生物珊瑚支架中的空间分布和基因表达分析

目的比较采用两种不同方法接种的hBMSCs在生物珊瑚支架中的三维空间分布和基因表达。方法采用传统接种法(A组)和纤维蛋白凝胶接种法(B组)构建hBMSCs和生物珊瑚支架复合体。A组孵育3h,B组孵育30min后检测两组细胞接种效率。培养后2、7、14、21d,两组分别取材行DAPI染色后,荧光显微镜观察,采用AxioVision图像分析软件测量每个切片10倍物镜视野中的细胞数量,以切片的不同水平区域(从表面到底部为L1～L5)和垂直区域(从中心到边缘)比较两组细胞分布情况;采用实时荧光RT-PCR检测成骨分化基因骨凝集素(osteonectin,ON)、核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)和骨钙素(osteocalcin,OC)表达。结果B组细胞接种效率为88.32%±4.20%,明显高于A组66.51%±12.33%(P<0.01)。培养后2d,两组细胞水平区域分布由L1～L4逐渐减少(P<0.05);垂直区域细胞数目比较,A组差异无统计学意义(P>0.05),B组差异有统计学意义(P<0.05);两组间各成骨分化基因表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养后7d,A组细胞数目较2d时逐步减少,各水平区域间细胞数目比较差异均有统计学意义(P<0.05),而B组细胞数目和各成骨分化基因表达量迅速增加,各水平区域细胞数目趋于平衡,细胞分布均匀(P>0.05),ON和Cbfα1基因表达量明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。培养后14d,A组各水平及垂直区域内的细胞数目均较7d时急速减少(P<0.05),B组细胞增殖良好且细胞总数与7d时相近;B组OC基因表达量达峰值,两组间各基因表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。培养后21d,两组各水平区域细胞数目和两组间各基因表达比较差异均有统计学意义(P<0.05);两组各垂直区域细胞数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养后7、14、21d,B组大部分区域细胞数目均较A组多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过纤维蛋白凝胶接种较传统方法接种可使hBMSCs在支架中空间分布更均匀,能达到更快的细胞增殖和更有效的成骨分化。

永生化hBMSCs复合异种骨异位成骨

目的为解决组织工程中种子细胞数量不足及为组织工程种子细胞研究提供标准细胞,建立永生化hBMSCs(MSCxj)系,进一步探讨MSCxj的异位成骨能力。方法取冻存复苏后生长良好的第35代和第128代MSCxj,扩增培养至2109个,分别与牛松质骨复合培养,作为A、B组(n=12),C组为单纯牛松质骨(n=12)。成骨诱导培养48h和18d时行扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。于18只4～6周龄裸鼠背部两侧皮下各作一3mm小切口,将3组共36个标本采用组内随机、组间两两配对分别植入切口内。处死动物前分别行四环素荧光标记。于术后4、8、12周各组分别取4个标本行HE、丽春红三色、四环素荧光染色、鼠抗人骨钙素单克隆抗体免疫组织化学染色观察,并行形态学定量分析。结果细胞-异种骨复合培养48h,扫描电镜观察见A、B组细胞贴附生长良好;18d可见大量合成的丝状细胞外基质及细小颗粒样分泌物,并覆盖细胞。裸鼠皮下埋植实验:HE、丽春红三色、四环素荧光染色观察示,术后4周A、B组标本成骨不明显,8周A、B组标本周边及异种骨内部孔隙有类骨基质沉积,12周A、B组标本成骨增加,A、B组间成骨情况比较无明显差异;C组各时间点均未见骨质形成。鼠抗人骨钙素单克隆抗体免疫组织化学染色显示,A、B组8周及12周骨陷窝内骨钙素染色呈阳性。形态学定量分析显示,术后8周A、B组骨长入率分别为5.64%±2.68%和4.92%±2.95%,术后12周分别为13.94%±2.21%和14.34%±3.46%,两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);组内术后12周骨长入率均高于术后8周,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MSCxj与原代培养hBMSCs一样具有良好的异位成骨能力,可作为骨组织工程的种子细胞进行相关实验及临床研究。

体外负压培养对hBMSCs成骨活性影响的初步研究

[目的]探讨体外负压培养对hBMSCs成骨活性的影响。[方法]取第3代hBMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17 kPa,30 m in/次,4次/d,干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,检测ALP活性,茜素红染色观察钙节结形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和VEGF的表达。[结果]诱导2周,实验组细胞增殖能力下降,S期细胞百分比为(5.14±1.56)%,较对照组(13.45±3.51)%约下降62.4%,细胞凋亡增加。实验组ALP活性为(15.68±1.97)mU/mg,对照组为(6.34±1.21)mU/mg,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组钙结节形成增多,VEGF表达较对照组显著提高;实验组Ⅰ型胶原表达呈阳性,对照组呈阴性反应。[结论]负压能抑制hBMSCs增殖,促进细胞凋亡,但可以提高细胞成骨活性。

mFVII／Fc融合基因慢病毒载体的构建及在hBMSCs中表达的研究

目的构建人凝血因子VII（FVII）与免疫球蛋白Fc片段融合基因（mFVII／Fc）的慢病毒表达载体，并检测其在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）中的表达情况，获取mFvII／Fc稳定表达的干细胞载体。方法体外克隆人凝血因子VII，用点突变技术在基因水平将341部位Lys突变为Ala后，利用DNA连接酶与免疫球蛋白IgG1 Fc片段的基因融合，经酶切整合，测序鉴定后转染人胚肾293T细胞包装为重组mFVII／Fc慢病毒载体，鉴定载体构建成功后，测定慢病毒滴度。确定转染第三代hBMSCs的最佳MOI值后批量转染，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，RT—PCR、ELISA分别在不同时间点对mFVII／Fc的mRNA及蛋白表达进行相对定量分析。结果所构建融合基因与GenBankID：AF272774对比，除同义变异外完全相符；包装的慢病毒滴度为2×10^8TU／ml；hBMSCs鉴定结果为CD＋（98．08％）、CD＋（97．63％）、CD；（0．31％）、CD＋（0．58％）；转染hBMSCs72h后的效率为（84±3）％，经RT—PCR及ELISA证实转染mFVII／Fc基因的hBMSCs有大量mRNA转录和蛋白表达水平。结论实验成功获得了融合基因的hBMSCs稳定遗传表达载体，为靶向前列腺癌组织因子研究及肿瘤基因治疗研究提供了实验依据。

高迁移率族蛋白1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进骨髓干细胞的趋化及成骨分化

目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)通过PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬对骨髓干细胞的趋化及成骨分化的影响。方法将人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)分为7组:control组、siRNA-NC组、siRNA-HMGB1组、pcDNA-NC组、pcDNA-HMGB1组、pcDNAHMGB1+siRNA-NC组、pcDNA-HMGB1+siRNA-PINK1组。采用Transwell检测细胞迁移能力;茜素红染色检测各组细胞中钙结节数目;ELISA检测骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)的含量;RT-qPCR检测各组细胞中成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、HMGB1及Runt相关转录因子2(RUNX2)、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)水平;透射电镜检测线粒体自噬小体数目;Western Blot检测hBMSCs中Parkin及微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)、选择性自噬接头蛋白62(P62)和自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1)等线粒体自噬相关蛋白的表达。结果HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的趋化作用研究表明:与pcDNA-NC组相比,pcDNAHMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达增加,Parkin、P62等蛋白的表达降低(P<0.05);与siRNA-NC组相比,siRNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ等表达降低,Parkin、P62表达增高(P<0.01)。HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的成骨分化作用研究结果显示:与pcDNA-NC组相比,pcDNAHMGB1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达升高(P<0.01),PPARγ、C/EBPα的表达降低(P<0.05);与pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组相比,pcDNA HMGB1+siRNA-PINK1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达降低(P<0.05),PPARγ、C/EBPα的表达升高(P<0.05)。结论HMGB1高表达能通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进hBMSCs的趋化、成骨细胞分化及抑制成脂细胞分化,可能是骨质疏松症的潜在治疗靶点。

缺氧条件下CXCL13通过MAPK信号通路促进人骨髓间充质干细胞增殖和自噬

目的探索CXC趋化因子配体13(CXCL13)对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)自噬和增殖的影响及机制。方法 hBMSC分为对照组、缺氧组、 CXCL13处理组、 CXCL13和SB203580的联合处理组。除对照组外,其余各组均在920 mL/L N_2、 30 mL/L O_2和50 mL/L CO_2建立的细胞缺氧模型下进行培养。缺氧组不进行任何处理, CXCL13处理组给予50 ng/mL CXCL13重组蛋白刺激,联合处理组则预先添加20μmol/L丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580,培养30 min后,再以50 ng/mL CXCL13刺激。分别采用噻唑蓝(MTT)法检测hBMSC增殖活性, annexinⅤ-FITC/PI双标记结合流式细胞术检测hBMSC的凋亡, Western blot法检测hBMSC的核因子κB(NF-κB)、 beclin-1蛋白水平, ELISA检测细胞裂解液自噬相关蛋白7(ATG7)的含量。结果与缺氧组及联合处理组相比, CXCL13处理组hBMSC的细胞增殖活性、 beclin-1及NF-κB蛋白水平均升高、凋亡率明显降低;细胞裂解液ATG7水平升高。结论缺氧环境下, CXCL13通过MAPK/NF-κB信号通路促进hBMSC自噬和增殖。