hCGβ与鼠补体片段C3d的连接及其在真核细胞中的表达

目的:构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用pcr方法在hCGβ cDNA3’端引入BamHI位点,然后利用酶切位点的互补性,与C3d3 cDNA连接,构建了pBS-hCGβ-C3d3质粒,最后插入真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游,以产生pcDNA3-hCGβ-C3d3。将此融合质粒转染瞬时表达系统 COS-7细胞表达相应产物。其无血清培养上清液用免疫亲和层析法纯化重组蛋白。Raji细胞免疫细胞化学技术鉴定表达产物准确性。结果:真核细胞瞬时表达系统 COS-7细胞经转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒后,可分泌hCGβ重组蛋白。1.0×105个 COS-7细胞转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒,经72h培养后,可产生152ng的hCGβ重组蛋白,且表达量随时间延长而增高。在有血清培养基中的分泌量明显高于无血清培养基。同时,用Raji细胞免疫细胞化学分析表达产物显示,纯化的表达产物既有C3d结合受体活性,亦有hCGβ抗原性。结论:利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接,构建了pc-DNA3-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,为提高hCGDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。

hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞中的分泌性表达、鉴定与纯化

目的 :构建带有 6个组氨酸纯化标签的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的分泌型真核表达质粒 ,在CHO细胞中获得具有生物学活性的重组蛋白的高效表达。方法 :利用高效真核表达载体phCMV1,构建phCMV1 6His hCGβ和phCMV1 6His hCGβ C3d3,脂质体法转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg ml)筛选抗性克隆。放射免疫法检测抗性克隆培液中hCGβ表达量 ,Westernblotting和Raji细胞免疫化学法鉴定hCGβ C3d3融合蛋白。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。 结果 :酶切及测序结果显示 ,phCMV1 6His hCGβ及phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确。在CHO细胞中成功地获得了hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达 ,phCMV1载体的表达效率是pcDNA3的 1 6倍。表达产物经纯化后得到了所需的hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白。 结论 :hCGβ和hCGβ C3d3融合蛋白在CHO细胞的高效表达为下一步比较hCGβ抗原及hCGβ

真核细胞表达质粒pCMV4增强hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力

目的 :比较以pCMV4和pcDNA3为载体的hCGβ C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力。 方法 :分别构建pcD NA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d3真核细胞表达质粒 ,并转染真核细胞瞬时表达系统COS 7细胞 ,以分析体外表达效率。抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d3质粒。对 6周龄BLAB C小鼠行DNA免疫。于末次免疫后 6周采血 ,用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价。 结果 :对COS 7体外表达效率分析 ,由pCMV4介导的hCGβ C3d3表达效率明显高于pcDNA3。动物DNA免疫结果 ,pCMV4 hCGβ C3d3刺激动物机体产生的免疫应答强度及免疫效果显著高于pcDNA3 hCGβ C3d3。 结论 :pCMV4真核表达质粒hCGβ C3d3体外表达效率及动物DNA免疫效力均显著高于pcDNA3真核表达质粒。

hCGβ在乳酸杆菌中的分泌性表达

目的 :探索乳酸杆菌携带表达 h CGβ避孕疫苗的抗生育作用。方法 :用 PCR从短小乳酸杆菌染色体中扩增得到 S-层蛋白的信号肽序列 ,将其与 h CGβ基因连接后克隆到乳酸杆菌整合型表达载体 p Ilac的 lac启动子下游 ,得到质粒 p Ilac h CGβ,电穿孔转化干酪氏乳酸杆菌 Lb. caseiCECT5 2 76。挑选转化后的耐药菌落 ,在含红霉素培养基中培养 ,抽提其染色体 DNA,PCR及测序鉴定证实 h CGβ基因整合到 Lb.casei的基因组中。h CG放免检测上清及细胞裂解液中的 h CGβ。结果 :h CGβ基因已经整合到 Lb.casei的基因组中 ;细菌产生的目的蛋白约有 3/ 4分泌进入培养上清 ,而加入诱导剂乳糖 2 1 h后 ,上清中的蛋白浓度达到峰值 ,为 440 m IU/ m L。重组菌在无选择压力条件下培养 5 0代后仍可分泌 h CGβ。结论 :h CGβ在乳酸杆菌中得到了稳定的。

CCR9/CCL25介导小鼠经生殖道hCGβ避孕疫苗粘膜免疫后B细胞归巢

目的:探讨hCGβ粘膜避孕疫苗体液免疫的分子机制。方法:分别用1010个重组乳酸杆菌Lb.pIlac、Lb.pIlac-hCGβ经小鼠生殖道粘膜途径免疫6～8周龄BALB/c小鼠,3周后相同剂量加强免疫1次。间接ELISA检测加强免疫后2周阴道灌洗液中抗hCGβIgG和IgA抗体滴度;ELISPOT检测分泌抗hCGβIgG和IgA抗体分泌细胞数;RT-PCR筛查小鼠子宫B细胞上18种趋化因子受体和相关趋化因子CCL25;FCM和ELISA分析CCR9/CCL25的表达。结果:经小鼠生殖道粘膜接种1010Lb.pIlac-hCGβ可在生殖道局部诱导产生抗hCGβIgG和IgA抗体,且以IgG抗体为主;局部存在抗hCGβIgG和IgA抗体分泌细胞,而以IgG抗体分泌细胞为主;粘膜免疫后,小鼠生殖道局部B细胞上CCR9表达增高,粘膜局部相应配体CCL25表达亦增高。结论:重组乳酸杆菌活疫苗Lb.pIlac-hCGβ经小鼠生殖道粘膜免疫可诱导有效的免疫应答;粘膜局部CCR9/CCL25可介导B细胞归巢至生殖道局部,这可能增强hCGβ粘膜避孕疫苗的避孕效果。

分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗的体液免疫效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性。方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达载体phCMV16HishCGβC3d3和phCMV16HishCGβ,在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβC3d3融合蛋白、hCGβ联合C3d3和单用hCGβ对BALBc与C57BL6小鼠进行免疫,共免疫两次,间隔4周,ELISA测定血清中的抗体滴度,比较各组的免疫效果。结果:无论是BALBc小鼠还是C57BL6小鼠,hCGβC3d3融合蛋白诱导产生的抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ与C3d3联合免疫和hCGβ单独免疫组。在BALBc小鼠,初次和再次免疫结果显示,C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍。C57BL6小鼠所显示出的体液免疫反应强度虽不如BALBc小鼠,但C3d3也使hCGβ的免疫原性增强了1259倍。结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅地提高hCGβ避孕疫苗的免疫原性,在个性差异很大的不同品系小鼠,C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力。

hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定

目的探讨融合基因人绒毛膜促性腺激素(hCG)-βC3d3在干酪乳酸杆菌有效表达,为研究携hCG-βC3d3融合基因的乳酸杆菌直接黏膜免疫奠定基础。方法用分子生物学技术构建质粒pIlac.hCG-βC3d3,电穿孔转化干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)CECT 5276,挑选转化后的耐药菌落,在含红霉素的MRS培养基中培养,0.5%乳糖诱导后,在不同时间取上清,化学发光法检测hCGβ,免疫细胞化学鉴定融合蛋白。结果经测序证实目的基因构建正确。免疫化学发光测定显示,转化成功的重组干酪乳酸杆菌在乳糖的诱导下可分泌hCGβ。免疫细胞化学鉴定显示hCGβ与C3d3融合成功。结论实现了重组乳酸杆菌Lb.hCG-βC3d3分泌性表达融合蛋白hCG-βC3d3。

人hCGβ真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的：构建人hCGβ真核表达载体，稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法：采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES—neo中，并加入酶切位点和6×His标签，得到重组表达质粒pIRES—neo—hCGβ-（His）6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，经G418加压筛选出阳性克隆。RT—PCR、Western blot及免疫荧光检测人hCGβ在B16细胞中的表达。结果：经限制性内切酶鉴定及序列分析，pIRES—neo—hCGβ一（His）6重组体构建正确，最终建立的表达人hCGβ基因的B16细胞系阳性率高于90％。结论：成功构建了真核表达载体plRES—neo—hCGβ-（His）6，建立的稳定转染人hCGβ小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达hCGβ基因。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究人hCGβ抗肿瘤基因疫苗的功能提供了良好的实验基础，为hCGβ在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。

分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗免疫原性及其抗血清中和hCG生物学活性的作用

本文观察分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白避孕疫苗体液免疫效力的能力。采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ,在CHO 细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ+弗氏佐剂和单用hCGβ免疫生育期雌性BALB/c 小鼠,共免疫两次,间隔4周。ELISA 测定血清中抗hCGβ抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清中和hCG 生物学活性的能力进行比较。结果表明hCGβ单独免疫组在加强免疫后才见抗体生成,其抗体滴度比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组低1995倍,C3d3的佐剂能力是弗氏佐剂的10倍(初次免疫)-32倍(再次免疫),并且hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的中和hCG 生物学活性的作用。实验证明通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGβ的体液免疫应答能力。

hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠及其抗血清对hCG诱导鼠子宫增重的抑制效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGb避孕疫苗的免疫原性。方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGb-C3d3和phCMV1-6His-hCGb,在CHO细胞中获得稳定、高效表达的重组蛋白,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGb-C3d3融合蛋白和单用hCGb间隔4周两次免疫生育期雌性BALB/c小鼠,ELISA测定血清中抗hCGb抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清拮抗hCG诱导的小鼠子宫增重效应进行比较。结果:C3d3使hCGb蛋白疫苗的免疫原性增强1 995倍,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的抑制小鼠子宫增重作用。结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGb的体液免疫应答能力,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清对hCG的生物学作用具有更强的抑制效应。

表达hCGβ的重组乳酸杆菌经口接种小鼠产生抗hCGβ体液免疫应答

目的：用表达hCGβ的重组乳酸杆菌活疫苗经口接种不同品系小鼠产生抗hCGβ免疫应答。方法：用10^8、10^9、10^10个重组乳酸杆菌Lb．hCGβ灌服6～8周龄雌性BALB／c和C57BL／6小鼠。3周后用相同剂量加强免疫1次。间接ELISA检测初次免疫后2～8周血清和阴道灌洗液抗hCGβIsG和IgA抗体滴度。流式细胞仪分析B和T细胞的增殖情况，ELISpot计数抗hCGβIsG和IsA抗体分泌细胞克隆数。结果：不同品系小鼠经口腔接种10^9、10^10Lb．hCGβ可诱导相近的免疫应答；而10。诱导的抗体滴度较低。在加强免疫后，10^9和10^10Lb．hCGβ诱导的抗血清结合hCGβ抗原的能力〉100ng／n11。Lb．hCGβ口腔接种后，BALB／c小鼠子宫和阴道的B细胞增殖；C57BL／6小鼠子宫及阴道的抗体分泌细胞克隆数较脾脏明显增多（P〈0．05）。结论：重组乳酸杆菌活疫苗Lb．hCGβ可经口接种诱导有效的抗hCGβ免疫应答，产生的应答强度与免疫剂量呈正相关。

化学发光磁酶免疫法检测血清游离hCGβ

采用高灵敏度、信号稳定的化学发光分析法对血清中游离的人绒毛膜促性腺激素β亚单位 （Free hCGβ）进行检测, 并对免疫分析进行条件优化和改进, 建立化学发光磁酶免疫检测方法. 利用3-（2′-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3″-邻氧酰苯基）-1, 2-二氧杂环丁烷（AMPPD）-碱性磷酸酶（ALP）化学发光体系, 用磁珠酶联免疫法对Free hCGβ进行检测, 其检测灵敏度较光度法提高了10倍, 线性范围为0.45～185.2 mIU/mL, 批间和批内相对标准偏差（RSD）均小于12%, 回收率为84%～120%之间, 临床标本的检测值与分光光度法的相关系数为0.955. 因此, 化学发光磁酶免疫分析法较分光光度法的精密度和灵敏度高, 可以作为检测血清中的Free hCGβ水平的一种可靠方法.

分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合增强hCGβ基因疫苗体液免疫应答

目的:提高hCGβ在真核细胞中的表达效率,观察分子佐剂C3d3增强hCGβ基因疫苗的体液免疫应答。方法:构建带有增强目的基因表达效率的狗胰岛素前原信号肽(DPPISS)的高效真核表达质粒pCMV4hCGβC3d3、pCMV4hCGβ和pCMV4C3d3。分别用pCMV4DPPISShCGβC3d3、pCMV4DPPISShCGβ和pCMV4DPPISShCGβ联合pCMV4DPPISSC3d3免疫BALBc小鼠,各组免疫剂量分别为5、10、50、100、500pmol,间隔3周相同剂量加强免疫1次。间接ELISA法分析免疫小鼠外周血抗hCGβ抗体动态变化以及IgG亚型。结果:含有DPPISS的pCMV4hCGβC3d3较无DPPISS的pCMV4hCGβC3d3在COS7细胞中的表达效率明显提高。50pmol是BALBc小鼠hCGβ基因免疫的最佳免疫剂量。C3d3使得BALBc小鼠hCGβ的免疫原性增强了400倍。hCGβC3d3免疫组IgG1IgG2a比值明显高于hCGβ免疫组和hCGβ与C3d3联合免疫组。结论:分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合能够显著增强hCGβ基因避孕疫苗的体液免疫应答及抗体类型转换。

异位hCGβ-CTP37基因疫苗的抗肿瘤作用

目的 :研究异位hCGβ CTP37基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法 :分离获取异位hCGβ CTP37的编码基因 ,并将 4拷贝基因以头尾串联形式克隆于真核表达载体TR42 1构建重组质粒TR42 1 CTP37.4,以PCR、酶切和DNA序列测定进行鉴定 ;肌内注射法对BALB/c小鼠实施 3次基因免疫 (1 0 0 μg/ 1 0 0 μl) (每只小鼠 ) ,间隔 3周 ,并以空载质粒为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体 ;免疫小鼠脾细胞经特异性抗原hCGβ刺激后 ,用3H TdR掺入法和同位素释放法分别检测其特异性淋巴细胞增殖活性和CTL细胞毒活性 ;皮下接种SP2 / 0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果 :TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠产生了较高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,与空载质粒组有显著差异 ;hCGβ蛋白刺激TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞生产了高水平的特异性淋巴细胞增殖活性 ,且明显高于空载质粒免疫小鼠 ;特异抗原诱导的TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 / 0 hCGβ细胞的CTL活性明显高于SP2 / 0 preS2 /S细胞 P <0 .0 1 ) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 / 0 hCGβ细胞后成瘤率为 1 0 0 % ,瘤重达 3 .37g,而TR42 1 CTP37.4质粒免?

hCGβ真核表达载体的构建和瞬时表达筛选

为探讨人绒毛膜促性腺激素 β亚基 (hCGβ)基因避孕疫苗的可能性。利用DNA重组技术将hCGβ的基因片段连接到真核表达载体pCMV4上 ,酶切分析鉴定正确构建了质粒DNApCMV4 -hCGβ。将质粒DNApCMV4 -hCGβ通过脂质体转染的方法导入体外培养的Hela细胞 ,双抗夹心ELISA法检测质粒DNApCMV4 -hCGβ在Hela细胞瞬时表达系统中特异性的表达了hCGβ。结果表明hCGβ表达含量 2 4h为 6 78ng/ml,4 8h为 1 5 2 4ng/ml,说明在体外瞬时表达了特异性hCGβ的pCMV4 -hCGβ真核表达载体能够作为DNA疫苗使用 ,为pCMV4 -hCGβ质粒DNA免疫小鼠进行DNA避孕疫苗的研究奠定了基础。

融合蛋白hCGβ-hC3d3增强人免疫活性细胞对hCGβ抗原的免疫原性

目的:探讨分子佐剂hC3d3与hCGβ的融合蛋白hCGβ-hC3d3作用于人外周血单个核细胞(PBMC)对hCGβ抗原的免疫原性的影响.方法:对人PBMC进行细胞分离纯化,分别用1、10、100 nmol/L的hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM等抗原体外作用于B细胞、B+T细胞、PBMC和Raji细胞8～12天,用3H-TdR掺入法了解不同抗原刺激后各组细胞增殖情况;用ELISA检测培养上清中总免疫球蛋白(Ig)水平;而ELISPOT可测定各种抗原刺激后Ig分泌细胞数量.结果:用不同浓度hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM作用于B细胞、B+T细胞、PBMC、Raji细胞8～12天后,3H-TdR掺入法分析显示:与hCGβ处理组相比,融合蛋白hCGβ-hC3d3能使各组细胞增殖明显升高,且呈浓度依赖性;100 nmol/L hCGβ-hC3d3与前3组细胞共培养上清中总Ig的含量分别为hCGβ刺激组的4倍、10倍和10.85倍,且呈浓度依赖性.ELISPOT结果与培养上清液检测结果类似,经与hCGβ-hC3d3共培养后Ig生成细胞较hCGβ组明显增加.结论:融合蛋白hCGβ-hC3d3明显增强人免疫活性细胞抗hCGβ的免疫原性.

hCGβ-C3d3基因免疫BALB/c小鼠选择性促进B细胞克隆扩增

评价分子佐剂C3d在基因免疫中选择性促进抗原特异性B细胞增殖作用。分别用质粒pCMV4-hCG-βC3d3和pCMV4-hCGβ免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为50 pmol。间隔3周相同剂量加强免疫1次。加强免疫后第1周及第2周,MTT法分析各组小鼠脾脏B细胞和T细胞增殖;ELISPOT法分析两免疫组小鼠脾脏hCGβ抗原特异性IgG分泌细胞。结果显示在加强免疫后第1周及第2周,hCG-βC3d3免疫组B细胞增殖能力显著高于hCGβ免疫组及正常对照组;而各组间T细胞增殖状况未见明显差异。hCG-βC3d3免疫组较hCGβ免疫组小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌hCGβ抗体的细胞数量均明显增加。结果表明分子佐剂C3d对于B细胞具有选择性克隆扩增作用。

C3d3通过促进脾脏B细胞高表达CXCR4增强hCGβ DNA免疫体液免疫效应

本文旨在探讨分子佐剂C3d3与hCGβ融合在基因免疫中增强抗hCGβ体液免疫效应的机制。分别用质粒pCMV4-hCGB-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测免疫小鼠外周血IgG/IgA类抗hCGβ抗体水平;ELISPOT分析免疫鼠脾脏组织IgG/IgA类抗体分泌细胞水平(ASC);RT-PCR分析免疫鼠脾脏B细胞趋化因子受体表达,RT-PCR和FCM分析CXCR4表达水平;RT-PCR和ELISA检测脾脏组织CXCL12表达水平。结果显示,pCMV4- hCGβ-C3d3免疫组外周血IgG类抗hCGβ抗体水平明显高于pCMV4-hCGβ免疫组;而IgA类抗hCGβ抗体水平在两组间无明显差异。pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组脾脏组织IgG类ASCs水平明显高于pCMV4-hCGβ组;两组间IgA类ASCs水平无明显差异。经pCMV4-hCGB、pCMV4-hCGβ- C3d3免疫鼠脾脏B细胞CXCR4表达明显高于对照组;且pCMV4-hCGβ-C3d3组明显高于pCMV4-hCGβ免疫组。CXCR4^+细胞与ASCs呈正相关,r=0.966,(P<0.05)。pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组脾脏组织CXC L12表达均显著高于对照组。结果表明,分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合,在基因免疫小鼠后能够显著升调节脾脏ASCs CXCR4表达,从而可能增强抗hcGβ基因疫苗的体液免疫效应。

hCGβ避孕疫苗研究进展

h CGβ避孕疫苗的研究已从结合疫苗进入到了基因工程及 DNA疫苗阶段 ,载体、佐剂和免疫途径是进一步增强 h