hIGF-1转基因促周围神经再生和抑制肌肉萎缩的实验研究

目的了解周围神经损伤后人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)体内转基因促周围神经再生和抑制肌肉萎缩的作用。方法构建hIGF-1的真核细胞表达质粒,90只雄性Wistar大鼠,建立坐骨神经再生室动物模型后随机分为3组。hIGF-1治疗组:挤压伤处神经外膜下即刻注射pcDNAhIGF-1和LipfectAmine混合液10μl(hIGF-1 DNA为4μg);模型组注射pcDNA3.1、LipfectAmine和生理盐水混合液10μl;空白对照组:不注射任何物质。根据不同的时间点(2天,7天,14天和28天)观察hIGF-1质粒转染、坐骨神经再生、骨骼肌萎缩、脊髓运动神经元细胞病理变化。结果不同时相再生神经纤维质和量、骨骼肌萎缩程度、中枢神经元的变化等hIGF-治疗组明显大于模型组和空白对照组(P<0.01)。超微结构见hIGF-1治疗组的再生神经纤维成熟度优于其它两组。结论周围神经损伤后hIGF-1体内转基因能促进周围神经的再生和抑制骨骼肌的萎缩。

人hIGF-1在Pichia pastoris酵母中的分泌表达及表达产物的鉴定

根据人ＩＣＦ－１（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１，ｈＩＧＦ－１）的天然基因序列，在尽量保存原基因序列的基础上，将一些密码子换成Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母的偏爱密码子，人工合成ｈＩＧＦ－１双链ＤＮＡ．将此合成基因整合人Ｘ－３３酵母的染色体上，用Ｚｅｏｃｉｎ＋平板筛选得到重组菌株．以胞外分泌的方式表达了ｈＩＧＦ－１蛋白，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，得到该表达产物的相对分子质量约为７２００．

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。

hIGF-1转基因抑制失神经肌肉萎缩的实验研究

目的了解人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)体内转基因抑制肌肉萎缩的作用。方法30只雄性Wistar大鼠,建立坐骨神经再生室动物模型后随机分为3组。hIGF-1治疗组:挤压伤处神经外膜下即刻注射pcDNAhIGF-1和LipfectAmine混合液10μl(hIGF-1 DNA为4μg);模型组:注射pcDNA3.1、LipfectAmine和生理盐水混合液10μl;空白对照组:不注射任何物质。术后8周行神经-肌电检查和腓肠肌肌湿重与肌纤维横截面积检测。结果术后8周检查小腿三头肌复合肌肉活动电位(CMAP)的最大波幅和潜伏期,腓肠肌肌湿重和肌纤维横截面积,hIGF-1治疗组明显好于模型组和空白对照组(P<0.01)。结论周围神经损伤后胰岛素样生长因子-1体内转基因能有效抑制靶肌肉的萎缩。

hIGF-1腺相关病毒质粒的构建、包装和滴度测定

目的:构建pAAV/biGF-1载体,并测定pAAV/hIGF-1病毒粒子包装盒病毒滴度。方法:将hIGF- 1基因克隆入pAAV腺病毒相关病毒载体,以HEK293包装细胞包装病毒颗粒,HT1080细胞检测病毒滴度。结果:获得插入方向正确的hIGF-1腺相关病毒载体,HEK293细胞包装得到了1012滴度的病毒上清。结论:成功构建了hIGF-1腺相关病毒载体,并且获得了较高滴度包装病毒颗粒。

hIGF-1工程细胞对糖尿病小鼠血糖的影响

目的:观察hIGF-1工程细胞移植对糖尿病模型小鼠的降血糖作用。方法:用高病毒滴度的病毒上清感染骨髓基质细胞,并植入糖尿病模型小鼠腹腔内,观察糖尿病模型小鼠血糖的变化。结果:稳定表达hIGF-1的骨髓基质细胞腹腔移植后,可见糖尿病小鼠的血糖明显下降(P<0.05)。结论:稳定表达hIGF- 1的骨髓基质细胞对糖尿病动物模型有降糖作用,说明IGF-1基因可作为糖尿病基因治疗的候选基因。

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达和活性检测

目的 克隆人胰岛素样生长因子Ⅰ型 (hIGF 1) ,构建真核表达载体并进行表达及活性检测 ,为IGF 1基因治疗糖尿病奠定基础。 方法 提取胎儿肝脏总RNA ,RT PCR法扩增IGF 1cDNA片段 ,重组于pUCM T载体 ,测序正确后构建表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞系COS 7,用原位杂交和免疫组织化学检测表达 ,收集培养上清以胰岛素刺激释放实验进行活性测定。 结果 扩增得到 710bp带有Kozak序列的IGF 1cDNA片段 ;成功构建了真核表达载体pCI neo hIGF 1;IGF 1在COS 7细胞得到了表达 ,并具有刺激胰岛素分泌的活性。 结论 新构建的载体pCI neo hIGF 1能在COS 7细胞中表达、分泌 ,且所分泌的IGF 1具有生物活性。

乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达

目的以含有人源性胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因的大肠杆菌DH5α为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时目的融合蛋白的表达规律。方法利用可表达hIGF-1的工程菌,研究乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌在不同条件下表达目的蛋白的一般规律,并优化表达条件,表达结果借助SDS-PAGE等方法进行分析。结果乳糖可诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达,最优表达条件为37℃下重组菌株生长至OD600值为0.7时加入诱导浓度为0.8%的乳糖继续诱导4h。诱导的目的融合蛋白相对表达量能够达到占总蛋白的40-60%水平,接近IPTG的诱导表达水平。结论乳糖能够代替IPTG作为诱导剂成功诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达。

胰岛素样生长因子-1工程细胞在糖尿病中的治疗作用

目的观察胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)工程细胞移植对糖尿病模型鼠的降血糖作用。方法将hIGF-1基因克隆入pAAV腺病毒相关病毒载体,以HEK293包装细胞及病毒颗粒,HT1080细胞检测病毒滴度。将高病毒滴度的病毒上清感染骨髓基质细胞(MSCs)并植入糖尿病模型小鼠腹腔内,观察病毒感染MSCs植入对糖尿病模型小鼠血糖的影响。结果成功构建了hIGF-1腺病毒相关病毒载体,HEK293细胞包装得到了1012滴度的病毒上清。MSCs病毒感染率达60%。稳定表达hIGF-1的MSCs腹腔移植后,可见糖尿病小鼠的血糖明显下降(P<0.05)。结论稳定表达hIGF-1的MSCs对糖尿病动物模型有降糖作用,说明IGF-1基因可作为糖尿病基因治疗的候选基因。

人IGF-1在大肠杆菌中的可溶表达和纯化

目的:在大肠杆菌中的可溶表达和纯化人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)。方法:根据hIGF-1的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成hIGF-1DNA序列,构建表达载体,在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中与硫氧还蛋白TrxA融合表达,并通过盐析和镍柱亲合层析进行纯化。结果:SDS-PAGE分析显示,重组融合蛋白以可溶形式存在,分子量约为28kDa,占上清总蛋白的50%以上。经盐析和镍柱亲合层析进行纯化,目标蛋白纯度可达到90%左右。结论:复合干扰素在大肠杆菌中的高效可溶表达。

胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性

目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。

水稻种子表达人源性胰岛素样生长因子1基因

人源性胰岛素样生长因子1(hIGF-1)是一类在许多人类疾病治疗中都具有重要作用的细胞因子。本研究成功构建了以水稻种子高效表达的谷蛋白Gt1基因5.3 kb启动子引导hIGF-1基因(higf-1)的表达载体:pCAMBIA 1301-5.3kbGt1-higf-1-nos。在此基础上,将构建好的表达载体,通过根癌农杆菌介导法转化水稻,获得转基因植株。通过对转基因水稻植株叶片总DNA的PCR检测,初步确定表达载体的T-DNA区段已经成功整合入水稻基因组中。目的基因RT-PCR检测结果显示,higf-1在转基因水稻种子中能够正常转录。开展本试验为利用水稻及其他单子叶植物表达IGF-1研究奠定了基础。

钴金属螯合亲和层析在hIGF-1融合蛋白分离纯化中的应用

为探讨钴金属螯合亲和层析应用于分离纯化制备人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)的可行性与纯化条件,以重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,使用钴亲和层析技术分离纯化其表达产物并与镍亲和层析比较,在此基础上尝试应用钴亲和层析分离纯化制备较大量的hIGF-1融合蛋白。结果显示,钴亲和层析在分离纯化hIGF-1融合蛋白时表现出更好的可操作性与纯化效果,线性放大条件后分离纯化效果稳定,制备hIGF-1融合蛋白产物纯度约为95%,蛋白获得率约为10.78%。研究初步建立了切实可行的钴金属螯合亲和层析分离纯化制备hIGF-1融合蛋白的工艺。