重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞体外增殖的影响

目的检测基因工程免疫毒素hIL-2-LuffinP1的体外生物学活性。方法采用分离的C57和BALB/c小鼠脾细胞进行混合淋巴细胞反应,刀豆球蛋白A(ConA)刺激BALB/c小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖实验,以LuffinP1毒素分子作为对照。3H-TdR核素掺入法检测hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用。以CTLL-2细胞检测hIL-2-LuffinP1对IL-2依赖细胞株的杀伤作用,实验共设6组:PBS、IL-2、LuffinP1、LuffinP1+IL-2、hIL-2-LuffinP1、hIL-2-LuffinP1+IL-2,CTLL-2细胞加入各组试剂培养12h,台盼蓝染色,计数每100个细胞中的死亡细胞数。结果随剂量增加,hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强,在10-6mol/L浓度时,抑制率可达到97%,而LuffinP1对淋巴细胞增殖无明显抑制作用。hIL-2-LuffinP1对Con A刺激的脾细胞活化也有抑制作用,与在混合淋巴细胞体系中一致,而LuffinP1对上述两个反应体系中的淋巴细胞增殖均无明显抑制作用。加入hIL-2-LuffinP1+IL-2和hIL-2-LuffinP1后CTLL-2细胞的死亡率分别为29.6%和47.4%,明显高于IL-2组(5.6%,P<0.01)。结论重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1在体外能够抑制淋巴细胞增殖,对表达IL-2R的活化淋巴细胞产生定向杀伤作用。

hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。

重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对大鼠肾移植存活时间的影响

目的以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用。方法采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察。结果hIL-2-Luffin P1组大鼠存活时间延长(13.86±2.11)d,与对照组比较相差显著(P<0.01);而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异。同时,病理结果显示对照组移植肾单位结构破坏,淋巴细胞浸润明显,而在同一时间hIL-2-Luffin P1处理组大鼠的移植肾脏病理变化较轻;T淋巴细胞亚群检测显示经hIL-2-Luffin P1处理后,受体外周血T细胞的活化程度降低。结论hIL-2-Luffin P1能够抑制免疫排斥反应,延长移植物存活时间。

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4+、CD8+ T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。

HIV-1 env与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将编码人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐＪ３８ｅｎｖ 的下游，构建成含有ＨＩＶ－１ ｅｎｖ 和ｈＩＬ－２两种外源基因的重组表达质粒ｐＪ３８Ｅ－ＩＬ－２，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖＪ３８Ｅ－ＩＬ２。经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ等检测证明：重组病毒能同时表达Ｅｎｖ 蛋白和ＩＬ－２蛋白，表达产物分子量分别为９８×１０３ 、１６×１０３。

HIV-1中国流行株gag-hIL-2重组痘苗病毒与pIRES-gag-hIL-2核酸疫苗联合免疫的实验研究

目的 将HIV 1中国流行株B亚型gag和hIL 2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达 ,与核酸疫苗联合免疫 ,评价免疫效果 ,为新型艾滋病疫苗开发研制奠定基础。方法 将HIV 1中国流行株gag hIL 2基因片段插入到痘苗病毒载体pJ38启动子下游 ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒 ,SDS PAGE、Westernblot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB c小鼠 ,进行淋巴细胞转化实验及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果 获得了重组痘苗病毒vJ38gag IL 2 ,具有更好的免疫原性 ,3rVV效果好于 2rVV ,以 2rVV DNA混合免疫效果最好。结论 重组痘苗病毒vJ38gag IL

重叠区扩增基因拼接法拼接hIL-2信号肽基因和CVB3的VP1基因

目的 :将 h IL- 2信号肽基因拼接到 CVB3VP1基因的 5′端 ,以获得分泌型 VP1 (s VP1 )基因。方法 :采用重叠区扩增基因拼接法。结果 :凝胶电泳见到预期大小 DNA条带 ,经测序表明基因序列与报导的 h IL- 2信号肽及 CVB3VP1的基因序列一致。结论 :成功获得了融合基因 s

共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的 研究HIV-1CN融合基因与IL-2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法 脂质体介导共表达中国流行株HIV-1gag-gp120基因与IL-2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果 杀伤实验结果证明,经基因免疫获得的 CTL效应细胞,可杀伤 HIV-1CN 融合基因转染的靶细胞。结论 pGPIL-2可有效地诱导 CTL的产生,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。

重组免疫毒素的纯化及鉴定

目的构建能特异性杀伤银屑病皮损中T淋巴细胞的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1。方法应用PCR扩增目的基因片段hIL2-Luffin P1,然后克隆到表达载体pET32a(+)中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序。测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达。诱导表达正确的蛋白,经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,最后用兔抗人IL-2多克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定。结果构建了pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1表达载体。最后得到了表达正确的hIL2-Luffin P1蛋白。结论重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为银屑病的治疗奠定了实验基础。

重组免疫毒素对同种小鼠皮肤移植排斥反应的抑制作用

目的观察重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对小鼠皮肤移植排斥反应的抑制作用。方法采用同种异体小鼠皮肤移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响、移植后外周血T细胞亚群变化以及移植物的组织病理学观察。结果hIL-2-Luffin P1组小鼠皮肤存活时间延长(13.86±2.11)d,与空白对照组比较相差显著(P<0.01),且与hIL-2-Luffin P1的剂量呈正相关;而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异。同时,移植后外周血T细胞亚群活化程度减轻,病理显示hIL-2-Luffin P1处理组移植皮肤淋巴细胞浸润较轻。结论hIL-2-Luffin P1能够抑制T细胞的异常活化,从而抑制免疫排斥反应,达到延长移植物存活时间的目的。