RNAi特异性抑制A20基因对H_2O_2诱导的HUASMC细胞表型的影响

目的:通过采用锌指蛋白A20基因干扰技术观察其对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞(HUASMC)超微结构影响,以初步研究锌指蛋白A20在氧化还原方面对细胞的保护作用。方法:将培养的人脐动脉血管平滑肌细胞随机分六组,空白组;A20siRNA组;scramble siRNA组;H2O2组;H2O2+A20siRNA组;H2O2+scramble siRNA,采用RT-PCR,Western-blotting方法观察A20基因表达变化,应用透射电镜观察细胞超微结构改变。结果:空白组A20mRNA与蛋白有微弱表达,A20siRNA组较空白组表达减少(P<0.05);H2O2组A20mRNA与蛋白表达明显高于空白组但显著低于H2O2+A20siRNA组(P<0.05)干扰效率大约55%。空白组平滑肌细胞(VSMC)电镜下呈典型的"收缩表型";H2O2组VSMC表型发生明显改变,呈"合成表型"H2O2+A20siRNA组成典型的合成表型且肌丝明显减少,细胞器及分泌物增多。结论:A20基因可以抑制H2O2损伤诱导的血管平滑肌细胞表型转化。

ERK信号转导通路在PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞增殖中的作用

了解ERK信号转导通路在PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞增殖中的作用。原代培养人脐动脉平滑肌细胞(hUASMC),取生长正常的细胞分4组:对照组,PDGF(platelet derived growth factor)组,ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。继续培养24h后,用免疫细胞化学技术测细胞核内核增殖抗原(PCNA)的表达;用MTT法测细胞的增殖活性。结果显示:1)与对照组相比,PDGF组细胞内PCNA的表达明显增强,MTT法测得A值也升高(P<0.01)。2)ERK阻断剂可完全抑制PDGF诱导的PCNA的表达增多和A值的升高。结论:ERK信号转导通路参与了PDGF诱导的人动脉平滑肌细胞的增殖。

栝楼籽蛋白酶解物的体外抗氧化及降血压活性

构建人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)氧化应激模型,采用栝楼籽蛋白酶解物(Protease Hydrolysates of Trichosanthes Seed,PHTS)处理细胞,检测细胞存活率和总谷胱甘肽(GSH)、内皮素(ET)水平,分析过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的基因与蛋白表达。结果表明,栝楼籽蛋白酶解物可有效提升HUASMC细胞的存活率和GSH、CAT、SOD表达水平,抑制ET分泌。

子痫前期血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响。方法:采用组织块贴壁法培养人早孕期细胞滋养细胞(CTB)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC),传代后建立滋养细胞与人脐动脉平滑肌细胞共培养模型并分别加入正常和子痫前期患者静脉血清培养24h,并设立相对应的单培养组;Transwell小室检测CTB的侵袭能力;细胞计数试剂盒(CCK-8)测定HUASMC活力;Annexin V-FITC检测HUASMC凋亡率;RT-PCR检测滋养细胞FasL mRNA与HUASMC的Fas mRNA的表达;W estern blot检测HUASMC的Fas蛋白的表达。结果:子痫前期患者血清能显著降低共培养体系中CTB的侵袭能力,上调HUASMC活力,降低HUASMC早期凋亡率、FasmRNA和Fas蛋白的表达。结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,降调共培养体系HUASMC Fas的表达,从而抑制HUASMC凋亡。

ERK参与调节人脐动脉平滑肌细胞内SMAD2/3蛋白及其mRNA的表达

目的了解ERK信号转导通路对人脐动脉平滑肌细胞(hUASMC)内SMAD2/3蛋白及其mRNA表达的影响。方法原代培养hUASMC,实验分四组:1)对照组,2)PDGF组,3)ERK阻断剂组,4)PDGF+ERK阻断剂组。分别用免疫细胞化学和RT-PCR法测hUASMC内磷酸化SMAD2/3蛋白和SMAD2/3mRNA的表达。结果1)与对照组相比,PDGF组hUASMC细胞内磷酸化SMAD2/3蛋白的表达增强(P<0·01);2)四组hUASMC细胞内SMAD2/3mRNA的表达无明显差异。结论在hUASMC中,ERK通路可促进SMAD2/3蛋白的磷酸化,但对SMAD2/3mRNA的表达没有影响。

IGF-1诱导PI3K-Akt通路磷酸化对平滑肌细胞的作用

目的比较胰岛素生长因子-1(IGF-1)对人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)和脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)增殖的影响并探讨其机制。方法采用人源HUVSMC和HUASMC进行研究,噻唑蓝(MTT)法检测IGF-1对两种细胞增殖的影响,并通过Western blotting技术检测IGF-1对两种细胞中PI3K-Akt信号通路的影响。结果不同浓度的IGF-1对HUVSMC和HUASMC的增殖都有明显的促进作用,但对HUVSMC的促增殖作用明显高于对HUASMC。进一步检测PI3K-Akt信号通路,IGF-1可激活PI3K-Akt信号通路,并且IGF-1对HUVSMC的激活明显强于HUASMC。IGF-1R抗体或wortmannin(渥曼青霉素)明显抑制IGF-1对细胞增殖的促进作用。结论 IGF-1可明显促进SMC增殖,并且在HUVSMC更为明显;IGF-1主要通过激活PI3K-Akt信号通路来促进平滑肌细胞的增殖。冠状动脉搭桥术(CABG)后静脉移植物比动脉移植物更容易发生内膜增生的原因可能就在于此。

Ⅰ、ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌对内皮细胞与平滑肌细胞共培养体系产生内皮素-1及一氧化氮的影响

目的研究不同fim A基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)刺激人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)及人脐动脉血管平滑肌细胞(human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs)共培养体系产生内皮素-1(endothelin-1,ET-1)和一氧化氮(NO)的水平。方法用Ⅰfim A型P.gingivalis(ATCC33277)和Ⅳfim A型P.gingivalis(W83)分别刺激HUVECs-HUASMCs共培养体系,于2、8、24、48 h时收集细胞培养上清液,酶联免疫反应检测ET-1的含量,硝酸还原酶法测定NO的含量。各组均设阴性对照组(纯培养基)及阳性对照组(1μg/m L E.coli-LPS)。结果 HUVECs-HUASMCs共培养体系在Ⅰ、Ⅳfim A型P.gingivalis刺激作用下产生ET-1和NO的量以及ET-1/NO水平,与阴性及阳性对照组比较存在差异。Ⅰfim A型P.gingivalis刺激细胞共培养模型分泌ET-1和NO情况的总趋势与阴性对照组相似、而Ⅳfim A型P.gingivalis的刺激作用总趋势则与阳性对照组相似,Ⅳfim A型P.gingivalis较Ⅰfim A型P.gingivalis刺激共培养细胞可分泌更多的ET-1、而NO量减少,Ⅳfim A型P.gingivalis感染48 h的细胞共培养模型表现出明显的ET-1/NO的失衡。结论不同fim A型P.gingivalis刺激共培养模型后产生ET-1及NO的情况及ET-1/NO的水平有明显差异,可能与其本身毒力相关,Ⅳfim A型P.gingivalis比Ⅰfim A型P.gingivalis更易引起内皮功能紊乱。

Fas/Fasl系统与子宫螺旋动脉重铸

胎盘滋养细胞正常侵入,子宫螺旋动脉成功重铸是正常妊娠的关键。Fas/Fasl系统在正常妊娠滋养细胞侵入,子宫螺旋动脉内皮细胞、平滑肌细胞凋亡方面发挥重要作用,有助于妊娠的维持。Fas/Fasl系统的表达异常引起子宫螺旋动脉重铸障碍能导致子痫前期的发生。对其深入研究,有助于揭示子痫前期的发病机制,有望为子痫前期的治疗提供新的靶点。

核不均一核糖蛋白A1在血管平滑肌钙化中的作用机制

目的研究核不均一核糖蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)是否可以通过IκBα/NF-κB信号通路调控平滑肌细胞的钙化过程。方法分离培养原代人脐动脉血管平滑肌细胞(human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs),构建pc DNA3.1-hnRNP A1真核表达质粒并转染HUASMCs,观察hnRNP A1对HUASMCs增殖和凋亡功能的影响。建立HUASMCs钙化模型,研究hnRNP A1在血管平滑肌钙化过程中的作用机制。结果 hnRNP A1表达水平在HUASMCs由收缩型转变为合成型的分化过程中显著上调,但hnRNP A1对HUASMCs细胞的增殖和凋亡功能无显著影响。无论是否给予H2O2刺激,hnRNP A1均可促进HUASMCs细胞形成钙化结节,其促进钙化的分子机制不是通过IκBα/NF-κB信号通路介导。结论本研究发现hnRNP A1在平滑肌细胞由收缩型向合成型转化的过程中表达上调,过表达hnRNP A1促进平滑肌细胞钙化。