内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(107拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。

山羊Hairless基因片段的克隆及序列分析

为了探讨Hairless基因在山羊毛发生长中的特异性功能,选用已经报道的Hairless基因的保守序列设计引物,对内蒙古绒山羊的基因组DNA进行PCR扩增,将扩增的目的片段克隆后测序,得到一段长1985bp的DNA序列,共涉及3段外显子和2段内含子,分别与已公布的牛和绵羊Hairless基因的cDNA序列比对,确定该绒山羊Hairless基因的特异性。

无毛基因敲除小鼠PPARγ-PGC1α-UCP1信号通路蛋白的表达及棕色脂肪组织能量代谢状态的变化

目的:探讨无毛(Hr)基因缺陷对小鼠能量代谢的影响及机制。方法:雄性Hr基因敲除(Hr^(-/-))小鼠和同窝野生型(Hr^(+/+))小鼠各10只,记录小鼠从出生后10周内的体重;于第10周,使用代谢监测系统对小鼠的耗氧量、产热量、活动量以及24 h进食量和饮水量进行监测,测量肛温,ELISA法检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(fT3)浓度,HE染色观察棕色脂肪组织(BAT),Western blot法检测BAT中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、PPARγ共激活因子1α(PGC1α)、解偶联蛋白1(UCP1)蛋白的表达。结果:出生后第1周至第10周,两组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。第10周,两组小鼠血清fT3浓度和活动量差异无统计学意义(P>0.05);与Hr^(+/+)小鼠比较,Hr^(-/-)小鼠的肛温、24 h进食量和饮水量、耗氧量和产热量升高(P<0.05),BAT内较多小空泡脂滴和较少大空泡脂滴,BAT中PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白表达增加(P<0.05)。结论:Hr基因缺陷可能通过激活PPARγ-PGC1α-UCP1信号通路,调节BAT能量代谢,从而使小鼠处于高能量代谢和高体温状态。

无毛小鼠同类系的建立

目的 :培育包含无毛基因的同类系小鼠新品系 ,明确无毛基因在不同遗传背景下的表达方式。方法 :将无毛基因通过杂交互交导入法分别导入 6 15、C57BL/6、BALB/c、DBA/2共 4种近交系。结果 :已完成 4代导入 ,杂交的第 1代、第 3代均表现有毛 ,第 2代、第 4代互交育出 6 15、C57BL/6、BALB/c、DBA/2共 4种无毛小鼠 ,其脱毛规律同豫医无毛小鼠。结论 :无毛基因可以在不同的遗传背景下表达。

昆明小鼠无毛基因cDNA全长序列的分子克隆

无毛基因是与皮肤和被毛结构有重要关联的核受体基因,编码一个锌指结构转录因子,是甲状腺激素受体的转录辅阻遏物,并参与毛发生长周期的调控,在维持毛囊及毛囊间上皮的增殖、分化、调亡的精致平衡中扮演重要角色。参考小鼠、人的无毛基因序列,用RT-PCR方法首次对昆明小鼠无毛基因的cDNA序列进行了克隆,获得了昆明小鼠无毛基因的全长4 014 bp cDNA序列(GenBank登录号:AY547391),基因的CDS长度为3 546 bp。AY547391基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAT45233,由1181个氨基酸组成。昆明小鼠与国外报导的小鼠、大鼠、猪、羊、猴、人等6种动物CDS序列同源性分别为99.9%、94.4%、83.1%、78.1%、81.9%、82.1%,氨基酸同源性分别是99.9%、92.2%、81.7%、70.8%、79.9%、80.1%。这一结果反应了无毛基因在进化过程的高度保守性。通过Blast比较昆明小鼠无毛基因与GenBank数据库中收集的Hr基因的mRNA,发现了4个SNP和一个缺失突变,其中3个位点没有改变氨基酸残基的性质,两个位点有氨基酸改变并证实为多态性突变位点,研究结果为无毛基因SNPs的数据库提供了新的信息。

豫医无毛小鼠无毛基因DNA原位PCR检测

目的 :探讨原位PCR技术对检测基因组变异的有效性。方法 :应用原位PCR检测豫医无毛小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片 ,并以健康昆明小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片、PCR反应液不加TaqDNA聚合酶、不加引物和引物不带生物素作为对照。结果 :豫医无毛小鼠皮肤和脾石蜡组织切片中检测到清晰的杂交信号 ,而且杂交信号位于细胞核内 ;4组对照均未出现杂交信号。结论 :原位PCR在基因组变异检测方面实用。

Uncv无毛小鼠无毛基因的分子克隆及序列分析

目的探讨Uncv无毛小鼠的无毛性状与无毛基因(hairless gene,hr)的相关性。方法参照Gen-Bank上公布的小鼠的hr序列,设计5对引物,用RT-PCR方法对本单位培育的Uncv无毛小鼠hr的编码区序列进行了克隆与分析。结果获得了Uncv无毛小鼠及野生型hr的全部编码区序列(3546 bp)。Uncv无毛小鼠hr基因与野生型小鼠hr基因的长度及序列完全一致,同源性为100%。与GenBank上发表的国外小鼠hr基因序列(Z32675)相比,同源性为99.7%,共10个碱基发生了突变,其中2个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;和昆明小鼠的hr(AY547391)相比,同源性为99.6%,共12个碱基发生了突变,其中3个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;但这些突变是由种属差异造成的。结论 Uncv无毛小鼠的无毛性状产生与hr基因无关。

豫医无毛小鼠无毛基因部分DNA序列分析

目的:探讨豫医无毛小鼠的无毛基因突变情况。方法:采用PCR方法扩增豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列,并进行克隆测序,将测序结果与国外公布的小鼠、大鼠及人无毛基因的cDNA序列做同源性比较和分析,确定该鼠无毛基因的特异性。结果:克隆测序结果为一923bp的片段,相当于Genbank上公布的小鼠无毛基因cDNA序列的3150～3565bp位置,包含4个外显子(外显子13～16)及3个内含子(内含子13～15);与本室以前所测昆明小鼠无毛基因部分DNA序列100%同源,其外显子部分共416bp,可编码138个氨基酸,与国外公布的小鼠、大鼠、人的无毛基因核苷酸同源性分别为100%、95%、84%,氨基酸同源性分别为100%、97.8%、84%。结论:①克隆定序了豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列;②排除了豫医无毛小鼠无毛基因的突变发生于本段序列的可能;③无毛基因在哺乳动物体内同源性很高,应属保守基因,其蛋白质产物可能在一些基本的调节途径中起重要作用,推测豫医无毛小鼠的无毛基因可能也位于14号染色体。

豫医无毛小鼠寿命观察

目的 :通过对豫医无毛小鼠寿命的观察 ,探讨突变基因对无毛小鼠寿命的影响。方法 :在正常生产繁殖状态下 ,随机选取无毛小鼠雌雄各 50只 ,杂合子有毛小鼠雌雄各 2 5只 ,饲养条件、营养状况、实验方法等均相同 ,观察每只小鼠自然衰老的过程 ,并计算出各自的寿命。结果 :纯合子无毛小鼠平均寿命雌性为 (30 3 .3± 35 .0 )d、雄性为 (2 61 .6± 41 .2 )d ,杂合子有毛小鼠平均寿命雌性为 (382 .7± 35 .7)d、雄性为 (353 .0± 37.2 )d。纯合子无毛小鼠与杂合子同性别有毛小鼠寿命相比差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )。结论 :突变基因可能对无毛小鼠的寿命有影响 。

豫医无毛小鼠无毛基因的比较生物学分析

目的:分析豫医无毛小鼠与其他物种间无毛基因组成的差异。方法:采用RT-PCR方法对豫医无毛小鼠无毛基因的cDNA序列进行克隆测序,并借助生物信息学分析技术对小鼠、大鼠、猴和人的无毛基因及其所编码的氨基酸序列进行比较生物学分析。结果:获得了豫医无毛小鼠无毛基因的全长4 014 bp的cDNA序列(GenBank登录号:AY547390)。豫医无毛小鼠与国内外报道的2种小鼠、大鼠、猴、人等5种动物的核苷酸同源性分别为99.9%、99.7%、94.3%、81.7%、81.8%,氨基酸同源性分别是99.8%、99.7%、94.5%、79.8%、80.0%。结论:无毛基因是一个高度保守基因,不同物种间具有高度同源性。

马氏珠母贝Su(H)基因克隆与组织特异性表达

Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。

BALB/c无毛同类系小鼠的分子遗传学特征分析

目的:探讨BALB/c无毛同类系小鼠无毛基因表型的分子遗传学基础。方法:采用PCR和RT-PCR方法扩增BALB/c无毛同类系小鼠和BALB/c小鼠无毛基因的部分序列,并对测序结果进行对比分析。结果:BALB/c无毛同类系小鼠无毛基因3110位碱基(外显子12)发生G→A突变,使911位的色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA)。结论:BALB/c无毛同类系小鼠谱系清楚,遗传机制明确,将是一种有价值的动物模型。

BALB/c无毛同类系小鼠的皮肤组织学及超微结构观察

目的:观察BALB/c无毛同类系小鼠皮肤特征。方法:用常规组织学及扫描电镜方法对正常有毛BALB/c小鼠及BALB/c无毛同类系小鼠皮肤结构进行了对比观察。结果:BALB/c无毛同类系小鼠12日龄左右发生脱毛现象,2周左右时除触须外全部脱净,并终生保持无毛状态;1月龄时无毛小鼠透过皮肤可见内脏,老龄时头部、腹部和体侧形成明显的皱纹和褶痕,似犀牛状,指甲过度生长。组织学发现BALB/c无毛小鼠毛囊瓦解,形成椭圆囊,真皮内形成大小不等的包囊,并且随年龄增长而扩张;无毛小鼠皮肤电镜扫描可见表面有许多鳞片状、泡沬状、角化物质沿皮肤沟排列;切面可见角质化的皮肤包囊和真皮包囊,真皮内弹性纤维排列凌乱。结论:BALB/c无毛同类系小鼠皮肤结构特点较有毛小鼠更接近于人,可作为新品系应用于皮肤病学研究。

无毛突变基因对无毛小鼠免疫器官结构及功能的影响

目的探讨无毛突变基因的作用,对无毛小鼠、有毛小鼠的免疫器官结构及功能进行了对比研究。方法比较无毛小鼠和有毛小鼠主要免疫器官组织学变化,以及血清白介素-2受体、淋巴细胞亚群、淋巴细胞增殖等方面的差别。结果发现无毛小鼠和有毛小鼠免疫器官结构及功能均有一定的差异。结论研究结果提示无毛突变基因不仅影响被毛结构,对免疫器官及功能也有一定的影响。该基因在杂合状态时也有一定的作用,表明该突变基因具有一定的共显性。

豫医无毛小鼠近交系毛色基因遗传学测试

目的 :考核豫医无毛小鼠 (YYHL)近交系纯化程度及毛色基因型。方法 :用复隐性基因小鼠DBA/ 2、6 15分别对YYHL近交系进行了毛色基因测试。结果和结论 :杂交所生的F1代全部为野生色 ,表明其毛色基因为纯合 ,其基因型为AABBccDD。豫医无毛小鼠近交系已达到近交系的国际标准。

豫医无毛小鼠无毛基因部分内含子突变研究

目的研究豫医无毛小鼠突变的分子机制。方法对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对二者扩增片段克隆后测序,对结果进行比较,以确定豫医无毛小鼠无毛基因的特异性程度。结果本实验共测出豫医无毛小鼠DNA序列1 746 bp和昆明小鼠DNA序列1 733 bp,两者不同之处有32处,均位于内含子,突变形式包括插入、缺失和点突变。结论无毛性状的产生可能与内含子中的插入、缺失和点突变有关。

豫医无毛小鼠无毛基因突变部位的定位和分析

目的:研究豫医无毛小鼠(YYHL)突变的分子机制。方法:对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对扩增片段克隆后测序,并与Musmuscnlus进行同源性分析。结果:共测出YYHL DNA序列1824bp和昆明小鼠DNA序列1816bp,其不同之处有27处,变异方式包括插入、缺失和点突变。其中在12外显子中有一无义突变(G→A),导致该部位由编码色氨酸的UGG转变为终止密码子UGA。结论:YYHL无毛性状的产生可能与基因组的变异有关。

Hr突变体转基因小鼠的构建和表型分析

无毛基因(Hr)定位于8p12,在染色体上跨越14 kb,包含19个外显子。无毛基因的自发突变能引起人和动物毛发脱落及相关毛发疾病的产生。为深入研究Hr基因的功能,本文利用Gateway技术构建Hr表达载体,在该基因的3 427位引入点突变(G→A),通过显微注射建立转基因小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6小鼠回交后互交数代建系。观察转基因小鼠毛发生长发育规律。结果表明,成功构建了pRP(Exp)-EF1A>m Hairless mutant>IRES/EGFP真核表达载体,通过与野生型小鼠杂交获得阳性子代,进行同窝交配,第2代小鼠出生后14 d开始脱发,30 d左右脱落的毛发重新长出。取部分皮肤组织做石蜡切片,皮肤组织学观察发现,脱毛期无毛小鼠毛囊瓦解,真皮内形成大小不等的包囊,毛发重新生长时,真皮内见大量新生的毛囊。蛋白印迹实验表明,转基因小鼠脱发时HR蛋白表达量明显高于同龄阴性小鼠。本文成功建立稳定遗传的Hr突变的转基因小鼠品系,推测无毛基因突变引发转基因小鼠的脱发,为研究Hr基因的功能提供了良好的动物模型。

豫医卷毛大鼠无毛基因cDNA序列的比较生物学分析

目的:对豫医卷毛大鼠的无毛(Hr)基因进行比较生物学分析。方法:采用PCR方法对豫医卷毛大鼠Hr基因的c DNA序列进行克隆、测序,并与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的Hr基因c DNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果:获得了豫医卷毛大鼠Hr基因全长5 232 bp的c DNA序列(Gen Bank登录号:KR109217)。豫医卷毛大鼠Hr c DNA与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的同源性分别为99.8%、87.3%、67.3%、70.2%、80.8%、79.8%、29.8%和24.9%,氨基酸序列的同源性分别为100.0%、92.9%、75.4%、74.8%、76.0%、77.8%、7.4%和11.7%。结论:Hr基因在哺乳动物中具有一定的保守性,与昆虫等非哺乳类动物之间具有较大的差异性。

豫医无毛小鼠中期染色体标本中无毛基因的原位PCR检测

目的 确立豫医无毛小鼠无毛基因的原位PCR荧光检测方法。方法 应用原位PCR的方法对豫医无毛小鼠中期染色体标本的无毛基因进行检测 ,并设立PCR反应液中无TaqDNA聚合酶、无引物、无bio - 11-dUTP等进行多组对照。结果 染色体标本上出现 1～ 2个黄绿色的扩增信号 ,而对照组则无。