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Handmade cloning:recent advances,potential and pitfalls 被引量:2
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作者 Geetika Verma JS Arora +2 位作者 RS Sethi CS Mukhopadhyay Ramneek Verma 《Journal of Animal Science and Biotechnology》 SCIE CAS CSCD 2015年第4期378-387,共10页
Handmade cloning (HMC) is the most awaited, simple and micromanipulator-ffee version of somatic cell nuclear transfer (SCNT). The requirement of expensive micromanipulators and skilled expertise is eliminated in t... Handmade cloning (HMC) is the most awaited, simple and micromanipulator-ffee version of somatic cell nuclear transfer (SCNT). The requirement of expensive micromanipulators and skilled expertise is eliminated in this technique, proving it as a major revolution in the field of embryology. During the past years, many modifications have been incorporated in this technique to boost its efficiency. This alternative approach to micromanipulator based traditional cloning O-C) works wonder in generating comparable or even higher birth rates in addition to declining costs drastically and enabling cryopreservation. This technique is not only applicable to intraspecies nuclear transfer but also to interspecies nuclear transfer (iSCNT) thus permitting conservation of endangered species. It also offers unique possibilities for automation of SCNT which aims at production of transgenic animals that can cure certain human diseases by producing therapeutics hence, providing a healthier future for the wellbeing of humans. The present review aims at highlighting certain aspects of HMC including recent advancements in procedure and factors involved in elevating its efficiency besides covering the potentials and pitfalls of this technique 展开更多
关键词 handmade cloning MICROMANIPULATOR Somatic cell nuclear transfer TRANSGENIC Zona free cloning
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Effects of Different Enucleation Methods on Developmental Potency of Pig Handmade Clone Reconstructed Embryos
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作者 Lv Lingyan Lu Xingrong +5 位作者 Sun Junming Pan Cuiling Lan Haien Wang Yanling Cui Kuiqing Xie Bingkun 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2016年第3期134-138,共5页
Effects of different enucleation methods on developmental potency of pig handmade clone(HMC)reconstructed embryo was investigated in the paper.We compared enucleation efficiency of blind cut method,first polar body... Effects of different enucleation methods on developmental potency of pig handmade clone(HMC)reconstructed embryo was investigated in the paper.We compared enucleation efficiency of blind cut method,first polar body(Pb1)positioning method and demecolcine(DM)assisted enucleation,as well as their effects on development of HMC reconstructed embryos.The results showed that overall enucleation efficiency of Pb1 positioning method was significantly higher than that of blind cut method(P〈0.05).The protuberance rate and overall enucleation efficiency of 0.4μg/mL DM treated group for 60 min was significantly higher than that of other concentrations and time treatment groups(P〈0.05).For effects on development of HMC reconstructed embryos,there was no significant difference between DM-assisted enucleation and Pb1 positioning method.In conclusion,appropriate addition of DM could enhance enucleation efficiency of HMC,which had no significant influence on developmental potency of reconstructed embryos. 展开更多
关键词 Enucleation methods Pig handmade clone Developmental potency
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化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植 被引量:3
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作者 杜卫华 李世杰 +2 位作者 郑敏 戴蕴平 李宁 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1843-1848,共6页
【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带,去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活... 【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带,去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体;分别以"血清饥饿"胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则3组间差异不显著(P>0.05)。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合,获得的克隆胚目前已发育到4-细胞期;另外,供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,提高核移植总效率。 展开更多
关键词 化学去核 无透明带 手工克隆(hmc) 小鼠
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小鼠卵母细胞化学去核及手工构建核移植胚胎 被引量:5
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作者 赵禹 刘军 +3 位作者 王保垒 张拓 刘根胜 张涌 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第10期102-106,共5页
为优化脱羰秋水仙碱(DC)诱导去核程序,研究以DC去核卵母细胞为核受体的、无透明带体细胞核移植方法在小鼠体细胞核移植中的应用,试验比较了乙醇、SrCl2两种激活方法及脱羰秋水仙碱处理开始时间对小鼠MⅡ期卵母细胞去核效率的影响;将DC... 为优化脱羰秋水仙碱(DC)诱导去核程序,研究以DC去核卵母细胞为核受体的、无透明带体细胞核移植方法在小鼠体细胞核移植中的应用,试验比较了乙醇、SrCl2两种激活方法及脱羰秋水仙碱处理开始时间对小鼠MⅡ期卵母细胞去核效率的影响;将DC诱导去核成功的卵母细胞去除透明带,与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。结果显示,7%乙醇激活后0 min起始DC处理可得到最高的诱导去核率(66.4%);而在8 mmol/L SrCl2中激活15 min后用DC处理可得到最高的诱导去核率(64.3%);目前重构胚可以体外发育到8-细胞。试验结果首次证明了SrCl2在小鼠卵母细胞DC诱导去核中的作用效果与乙醇相当,初步证明了将DC诱导去核技术与无透明带技术相结合手工克隆生产小鼠重构胚的可能性,它的成功将大大简化核移植程序。 展开更多
关键词 小鼠 化学去核 无透明带 手工克隆
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猪手工体细胞核移植电融合/激活参数的优化 被引量:4
5
作者 任子利 赵彦玲 +3 位作者 杨小淦 陆阳清 卢晟盛 卢克焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1246-1252,共7页
通过对猪体细胞核移植中电融合及联合化学激活对猪重构胚发育能力进行探讨,为广西巴马小型猪的手工克隆搭建平台。利用手工克隆(HMC)技术对猪体细胞核移植胚胎采用不同的电融合方法和融合后化学激活不同时间,研究猪手工克隆胚胎的发育... 通过对猪体细胞核移植中电融合及联合化学激活对猪重构胚发育能力进行探讨,为广西巴马小型猪的手工克隆搭建平台。利用手工克隆(HMC)技术对猪体细胞核移植胚胎采用不同的电融合方法和融合后化学激活不同时间,研究猪手工克隆胚胎的发育能力。结果表明:(1)对重构胚进行一步法电融合时,参数2(180V·mm-1,30μs×1次)与参数1(160·mm-1,30μs×1次)两组间的融合率差异显著(65.31%vs58.33%,P<0.05);(2)对重构胚进行两步法融合时,参数3(第一次:180V·mm-1,10μs×1次,融合60min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80μs×1次)和参数4(第一次:200V·mm-1,10μs×1次,融合60min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80μs×1次)两组间的总融合率差异不显著(75.88%vs81.20%,P>0.05);(3)采用参数4与采用参数2融合的重构胚其分裂率和囊胚率均差异不显著((79.98%vs72.66%)和(13.14%vs9.36%),P>0.05);(4)在电激活和CHX+CB联合激活4、5、6h这3组中,其分裂率和囊胚率均差异不显著(P>0.05)。相对而言,重构胚采用参数4的两步融合法和CHX+CB激活5h效果较好。 展开更多
关键词 卵母细胞 手工克隆 体细胞核移植
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利用改进的手工克隆技术生产转GFP基因猪克隆胚胎 被引量:5
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作者 张鹏 杨珍珍 +6 位作者 窦红伟 李伟杭 律波 Bolund Lars 杜玉涛 谭萍萍 马润林 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期527-532,共6页
通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用。文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本... 通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用。文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本。首先将增强型绿色荧光基因(EGFP)导入猪胎儿成纤维细胞中,通过荧光观察EGFP的表达来筛选适合做细胞核移植的体细胞。这样避免了外源EGFP基因虽已整合至猪基因组但不表达的情况,保证供体细胞100%是表达目标蛋白(绿色荧光蛋白)的细胞;然后利用新一代体细胞核移植技术——手工克隆技术(Handmade cloning,HMC)将供体细胞与卵母细胞融合生产胚胎。共收集了4个批次378个肉用家猪的卵母细胞,经体外培养成熟后手工去核得到266个去核卵母细胞,与EGFP细胞融合后获得127个重构胚胎,将重构胚胎体外培养到144 h,得到转基因囊胚65个,平均囊胚率为52.1±8.3%。与传统SCNT相比,HMC不仅操作简便,而且能大幅提高核移植细胞的囊胚率。更为重要的是,改进的手工克隆技术摆脱了昂贵的显微操作仪,为产业化生产转基因动物提供了新的实用基础。 展开更多
关键词 手工克隆 体细胞核移植 绿色荧光蛋白 克隆胚胎
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SAHA处理对猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响 被引量:2
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作者 孙俊铭 崔奎青 +5 位作者 李志鹏 陆杏蓉 许钟峯 刘庆友 黄奔 石德顺 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第5期104-108,264,265,共7页
为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对德保猪手工克隆胚胎(HMC)发育潜能的影响,试验摸索SAHA的适宜处理浓度[0(对照),1.0,2.5,5.0,7.5,10.0μmol/L]和时间(0,6,12,24 h);之后分为4组,SAHA组、体外受精(IV... 为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对德保猪手工克隆胚胎(HMC)发育潜能的影响,试验摸索SAHA的适宜处理浓度[0(对照),1.0,2.5,5.0,7.5,10.0μmol/L]和时间(0,6,12,24 h);之后分为4组,SAHA组、体外受精(IVF)组、孤雌激活(PA)组、对照(HMCC)组,分别在体外发育的1细胞期、2细胞期、4细胞期、囊胚期收集胚胎,在相同时期下比较各组胚胎组蛋白H4K8乙酰化(Ac H4K8)水平差异和相关基因(HDAC1、HAT1、ASF1A、OCT-4)相对表达量。结果表明:7.5μmol/L SAHA处理囊胚率显著高于对照(P〈0.05),12 h囊胚率显著高于0 h(P〈0.05);所以适宜处理浓度为7.5μmol/L,适宜处理时间为12 h。在1细胞期、2细胞期、囊胚期,SAHA组Ac H4K8水平接近IVF组水平(P〉0.05)。在囊胚期,SAHA组HDAC1基因相对表达量接近IVF组(P〉0.05);在囊胚期,SAHA组OCT-4基因相对表达量接近IVF组(P〉0.05)。说明SAHA可以使HMC胚胎Ac H4K8水平接近IVF水平,并纠正克隆胚胎乙酰化的异常,从而提高克隆胚胎发育潜能。 展开更多
关键词 手工克隆 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化酶(HATs) 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)
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亮甲酚蓝筛选对广西巴马小型猪孤雌激活及克隆重构胚早期发育的影响 被引量:4
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作者 苏克同 卢克焕 卢晟盛 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1218-1222,共5页
【目的】探讨亮甲酚蓝(BCB)染色是否可以筛选出发育潜能优秀的卵母细胞。【方法】猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟培养前用13μmol/LBCB染色,根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性(BCB+,蓝色)和阴性组(BCB-,不着色),以在不含BCB的... 【目的】探讨亮甲酚蓝(BCB)染色是否可以筛选出发育潜能优秀的卵母细胞。【方法】猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟培养前用13μmol/LBCB染色,根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性(BCB+,蓝色)和阴性组(BCB-,不着色),以在不含BCB的改良杜氏磷酸盐缓冲液(m-DPBS)中处理90min为控制对照组,直接培育作空白对照,体外成熟培养后统计各组卵母细胞的核成熟率及孤雌激活胚胎、克隆重构胚胎(供体细胞来自广西巴马小型猪)的早期发育率。【结果】BCB+组卵母细胞的核成熟率(80.8%)显著高于BCB-组(44.2%)和空白对照组(72.4%);BCB+组的孤雌囊胚形成率(32.9%)显著高于BCB-组(10.1%),但与对照组(25.8%)之间无显著差异;BCB+组显微操作核移植胚胎的囊胚发育率(14.1%)显著高于BCB-组(3.4%),但与对照组之间无显著差异;各组手工克隆胚胎发育率之间无显著差异。【结论】BCB染色筛选出的卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但未能显著改善广西巴马小型猪显微操作及手工克隆胚胎的早期发育。 展开更多
关键词 广西巴马小型猪 卵母细胞 亮甲酚蓝 核成熟 孤雌激活 显微操作 手工克隆
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陕北白绒山羊体细胞手工核移植研究 被引量:1
9
作者 于鸿浩 闫海龙 +3 位作者 敬晓琪 胡军和 冯平 屈雷 《四川动物》 CSCD 北大核心 2013年第6期819-823,共5页
手工核移植是不依赖于显微操作仪的核移植方法,卵母细胞去核以及去核卵母细胞与供体细胞融合是其技术难点。本研究优化了山羊卵母细胞手工去核方法,优化后的卵母细胞复圆率为83.45%±3.2%,去核率为98.61%±1.9%;建立了去核卵母... 手工核移植是不依赖于显微操作仪的核移植方法,卵母细胞去核以及去核卵母细胞与供体细胞融合是其技术难点。本研究优化了山羊卵母细胞手工去核方法,优化后的卵母细胞复圆率为83.45%±3.2%,去核率为98.61%±1.9%;建立了去核卵母细胞与供体细胞化学辅助融合方法,融合率为89.05%±4.33%。利用优化后的去核方法和化学辅助融合法制备了山羊克隆胚,克隆胚卵裂率为83.45%±2.47%,囊胚发育率为23.4%±5.83%。本研究建立了基于手工核移植技术的山羊体细胞克隆技术体系。 展开更多
关键词 核移植 手工克隆 山羊 去核 融合
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无透明带核移植技术 被引量:2
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作者 胡军和 杨春荣 窦忠英 《细胞生物学杂志》 CSCD 2005年第2期168-172,共5页
近几年,虽然体细胞核移植研究取得了巨大的成就,但是基本上沿用Willadsen最初的方法——去核、注核、融合和激活。而且所获得的克隆动物往往会出现很多问题如器官发育异常等,其中的原因不清。因此,人们试图革新原有的核移植方法,并建立... 近几年,虽然体细胞核移植研究取得了巨大的成就,但是基本上沿用Willadsen最初的方法——去核、注核、融合和激活。而且所获得的克隆动物往往会出现很多问题如器官发育异常等,其中的原因不清。因此,人们试图革新原有的核移植方法,并建立了新的核移植方法——无透明带核移植法,以期提高核移植的效率及解决核移植中存在的问题。现对无透明带核移植技术的两种方法——反向核移植法和手工核移植法以及单个胚胎培养系统进行介绍。 展开更多
关键词 无透明带核移植技术 体细胞核移植 反向克隆 手工克隆 单胚胎培养系统
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水牛活体采卵和无透明带胚胎培养体系的优化
11
作者 杨春艳 郑海英 +3 位作者 李玲玉 黄加祥 黄春丽 尚江华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第12期4008-4015,共8页
本研究旨在探索哺乳动物体外受精(IVF)胚胎单独或少量培养时发育效率低、无透明带胚胎的体外发育潜能受阻的问题,以期建立提高水牛活体采卵(ovum-pick-up,OPU)和徒手克隆(handmade clone,HMC)胚胎发育潜能高效稳定的体外生产体系。研究... 本研究旨在探索哺乳动物体外受精(IVF)胚胎单独或少量培养时发育效率低、无透明带胚胎的体外发育潜能受阻的问题,以期建立提高水牛活体采卵(ovum-pick-up,OPU)和徒手克隆(handmade clone,HMC)胚胎发育潜能高效稳定的体外生产体系。研究首先比较了单个微滴内共培养的胚胎数量(1、3、5、10和20枚)对胚胎发育效果的影响;而后采用微穴体系(well-of-the-well,WOW)和辅助共培养体系(培养微滴中添加包埋IVF胚胎的琼脂糖小块)培养OPU-IVF胚胎,并用WOW体系培养无透明带的徒手克隆重构胚,与传统的微滴培养体系比较其体外发育效果。结果表明:单个微滴内培养的胚胎数量为1、3和5枚时,囊胚发育率极显著低于10枚和20枚组(P<0.01);与微滴培养体系相比,辅助共培养和WOW体系均极显著提高OPU-IVF胚胎的囊胚率(P<0.01),且WOW培养体系极显著促进HMC重构胚的卵裂率和囊胚率(P<0.01)。综上所述,胚胎群体培养有助于胚胎发育,在保证系谱明确的前提下琼脂糖包埋辅助胚胎共培养体系和WOW体系提高了OPU-IVF体外胚胎发育效率,且WOW体系还可用于无透明带胚胎的高效培养。 展开更多
关键词 水牛 活体采卵(OPU) 徒手克隆(hmc) 琼脂糖包埋 微穴体系
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5-Aza-CdR对德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育效果的影响
12
作者 吕玲燕 陆杏蓉 +5 位作者 孙俊铭 陈宝剑 吴永绍 孙如玉 汪燕玲 崔奎青 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第11期3144-3152,共9页
为了探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对德保黑猪手工克隆(HMC)重构胚胎体外发育效果的影响,本研究分别从供体细胞和重构胚入手,比较了5个不同处理浓度(0、5、10、20和40nmol/L)5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理浓... 为了探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对德保黑猪手工克隆(HMC)重构胚胎体外发育效果的影响,本研究分别从供体细胞和重构胚入手,比较了5个不同处理浓度(0、5、10、20和40nmol/L)5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理浓度;在最佳浓度下比较5个不同处理时间(0、24、48、72和96h)对HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理时间;用4个不同浓度(0、0.25、0.5和1μmol/L)5-Aza-CdR结合最佳浓度和最佳时间处理供体和重构胚,比较其体外发育潜能。结果显示,与空白对照组相比,5、10、20和40nmol/L5-Aza-CdR处理72h对重构胚卵裂率均无显著差异(P>0.05),20nmol/L 5-Aza-CdR处理能显著提高重构胚的囊胚率(P<0.05),10和20nmol/L 5-Aza-CdR处理均能显著提高囊胚细胞数(P<0.05),其中以20nmol/L 5-AzaCdR效果最佳;与空白对照组相比,利用20nmol/L 5-Aza-CdR处理HMC重构胚72h能显著提高重构胚的囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05),其余处理时间对重构胚卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响(P>0.05);在囊胚的最佳处理浓度(20nmol/L)和最佳处理时间(72h)下,结合供体的4个处理浓度(0、0.25、0.5和1μmol/L),同时处理重构胚和供体,各处理组HMC重构胚的发育潜能均有提高,但效果均不显著(P>0.05),其中0.25~0.5μmol/L 5-Aza-CdR处理效果较佳。综上表明,适宜浓度(0.25~0.5μmol/L)的DNA甲基化酶抑制剂5-AzaCdR处理供体细胞72h并结合20nmol/L 5-Aza-CdR处理重构胚72h均能有效提高德保黑猪HMC重构胚胎的体外发育潜能,该结果可为今后研究德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化调控机制提供参考。 展开更多
关键词 5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) 德保黑猪 手工克隆(hmc) 发育效果
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牛体细胞核移植方法研究
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作者 贾瑞贞 李煜 +1 位作者 杨利军 黄翔华 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2008年第5期53-57,共5页
研究了牛体细胞核移植过程的去核方法、融合条件等对重构胚发育的影响,旨在探索一种简化的核移植操作程序。结果表明,添加FSH,LH,最高成熟率为81.7%。在电压为2.6 kV/cm时,融合率为93.96%。激活后重构胚在压制的WOW内进行培养,采用半卵... 研究了牛体细胞核移植过程的去核方法、融合条件等对重构胚发育的影响,旨在探索一种简化的核移植操作程序。结果表明,添加FSH,LH,最高成熟率为81.7%。在电压为2.6 kV/cm时,融合率为93.96%。激活后重构胚在压制的WOW内进行培养,采用半卵法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别为61.2%和3.27%,盲切法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别是70.8%和7.56%。 展开更多
关键词 体细胞 核移植 徒手克隆
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丙戊酸处理对猪手工克隆重构胚体外发育潜能的影响
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作者 谢炳坤 吕玲燕 +5 位作者 陆杏蓉 崔奎青 孙俊铭 覃兆鲜 石德顺 刘庆友 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期180-186,共7页
为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对猪手工克隆(HMC)胚胎发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0、25、50、75和100nmol/L)VPA处理猪HMC重构胚对后期胚胎发育率、内细胞团数和组蛋白乙酰化程度的影响。结果表明,5... 为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对猪手工克隆(HMC)胚胎发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0、25、50、75和100nmol/L)VPA处理猪HMC重构胚对后期胚胎发育率、内细胞团数和组蛋白乙酰化程度的影响。结果表明,50、75nmol/L VPA处理组HMC重构胚的卵裂率和囊胚发育率均显著高于0、25和100nmol/L VPA处理组(P<0.05);与0、25、75和100nmol/L相比,50nmol/L VPA处理组能显著提高囊胚内细胞团细胞数(P<0.05),囊胚阶段VPA处理组的组蛋白H3K14乙酰化(AcH3K14)水平高于空白组和孤雌激活囊胚。因此,应用VPA处理可提高猪HMC重构胚胎分裂率、囊胚率及增加内细胞团细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。 展开更多
关键词 手工克隆 丙戊酸 发育潜能
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甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理对德保猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响 被引量:3
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作者 陆杏蓉 孙俊铭 +5 位作者 李志鹏 李兰玉 谢炳坤 刘庆友 石德顺 崔奎青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1274-1281,共8页
供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维... 供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维细胞,将处理后成纤维细胞作供体进行手工克隆。结果显示:各处理组细胞生长曲线均呈"S"型,其中0.25μmol·L^(-1)组细胞生长曲线与对照组最相近。随着5-Aza-CdR浓度增加,细胞均有不同程度的畸变、生长抑制甚至致死。0.00~0.50μmol·L^(-1)5-Aza-CdR处理对德保猪成纤维细胞不会显著改变其细胞染色体整倍性。5-Aza-CdR不同程度下调了德保猪耳成纤维细胞中Dnmtl、Tet1、Tet2和Tet3的相对表达,对Dnmt1、Tet1和Tet3表达量的下调呈剂量相关。以处理后成纤维细胞作供体,猪手工克隆重构胚体外发育的卵裂率(24、48 h)和桑椹胚率各组间差异不显著(P>0.05),其中0.25μmol·L^(-1)组和0.50μmol·L^(-1)组囊胚发育率显著高于1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与对照组差异不显著(P>0.05)。0.50μmol·L^(-1)组囊胚细胞数显著高于对照组和1.00μmol·L^(-1)组(P<0.05),而与0.25μmol·L^(-1)组之间差异不显著(P>0.05)。综上表明:高浓度5-Aza-CdR对德保猪成纤维细胞增殖和染色体具有副作用,低浓度(≤0.25μmol·L^(-1))的5-Aza-CdR可用于供体处理以降低克隆胚胎甲基化水平及提高手工克隆猪胚胎发育潜能。 展开更多
关键词 手工克隆 5-AZA-CDR 重编程
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哺乳动物手工克隆的研究进展 被引量:2
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作者 韩梅 袁超 +3 位作者 郭婷婷 吴怡 岳耀敬 杨博辉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期54-61,共8页
体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)基本上分为传统克隆(Traditional cloning,TC)和手工克隆(Handmade cloning,HMC)。虽然随着SCNT的推进,科研人员已经利用TC成功克隆出多种动物,但这种方法需要使用昂贵的显微操作... 体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)基本上分为传统克隆(Traditional cloning,TC)和手工克隆(Handmade cloning,HMC)。虽然随着SCNT的推进,科研人员已经利用TC成功克隆出多种动物,但这种方法需要使用昂贵的显微操作仪,并且克隆效率较低。因此,TC逐渐被新方法HMC替代,HMC是一种通过手工操作将体细胞与两个去核的半卵母细胞融合、激活,并在培养系统中培养后产生胚胎的方法。HMC不仅操作程序简单、不需要显微操作仪、成本较低,还可以提高囊胚率,使克隆技术向生产应用又迈进了一大步。主要对HMC的操作程序、表观遗传重编程异常和HMC重编程异常修复进行了综述,并对HMC进行了展望,以期能够更好地将其应用到生产中去。 展开更多
关键词 哺乳动物 手工克隆 限制因素 手工克隆效率的提高
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哺乳动物体细胞手工克隆研究进展 被引量:2
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作者 王建华 李跃民 《动物医学进展》 CSCD 2008年第S1期18-21,共4页
采用化学去核和无透明带技术相结合,对哺乳动物卵母细胞进行处理,使通过该方法获得的去核无透明带卵母细胞作为受体,进行体细胞核移植,从而获得克隆动物。该方法完全避免了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,是纯粹的手工克隆,它的成功... 采用化学去核和无透明带技术相结合,对哺乳动物卵母细胞进行处理,使通过该方法获得的去核无透明带卵母细胞作为受体,进行体细胞核移植,从而获得克隆动物。该方法完全避免了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,是纯粹的手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,提高核移植总效率,同时提高核移植的生产力。论文对手工克隆的研究进展,手工克隆的机理,手工操作的体细胞核移植方法及影响手工克隆的因素进行综述。 展开更多
关键词 化学去核 无透明带 手工克隆
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手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究 被引量:1
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作者 陶瑞鑫 贾超 +1 位作者 武恩在 李娟 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第7期13-19,共7页
手工克隆(handmade cloning,HMC)是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力。本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切... 手工克隆(handmade cloning,HMC)是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力。本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切割去核与无透明带重构胚的体外培养展开研究。结果显示,猪卵母细胞透明带以3.3 mg/mL链酶蛋白酶适度消化(10~15 s),在切割去核时卵母细胞死亡率显著低于透明带的过度(高于15 s)消化,死亡率分别为(3.22±1.08)%和(31.45±2.10)%;当透明带消化时间不足(少于10 s),不能被切割去核的猪卵母细胞显著升高,不可切割率分别为(18.25±4.22)%和(0.57±0.40)%。另外,"铡刀式"操作更适用于手工切割去核,其操作要点对成功获得无核半卵及其胞质含量非常重要。HMC无透明带重构胚体外培养时,孔深约250μm、孔径约300μm的微孔技术(well of wells,WOWs)有利于克隆胚胎发育。本研究优化了HMC操作的关键步骤,为提高生产克隆猪胚胎效率奠定了基础。 展开更多
关键词 体细胞核移植技术 手工克隆 透明带 切割去核
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影响奶牛体细胞手工克隆技术因素的研究
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作者 张诺 杜卫华 +3 位作者 郝海生 王栋 武珅 朱化彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1315-1319,共5页
旨在优化奶牛的手工体细胞克隆技术方案,本试验以牛卵母细胞为材料研究了2个半卵不同粘合交流电压、重构胚不同激活方法和不同的COCS采集方法对奶牛手工体细胞克隆胚发育的影响。结果表明,(1)降低2个半卵粘合交流电压能显著提高其随后... 旨在优化奶牛的手工体细胞克隆技术方案,本试验以牛卵母细胞为材料研究了2个半卵不同粘合交流电压、重构胚不同激活方法和不同的COCS采集方法对奶牛手工体细胞克隆胚发育的影响。结果表明,(1)降低2个半卵粘合交流电压能显著提高其随后的卵母细胞融合率(P<0.05);(2)A23187+6-DMAP组激活的无透明带重构胚分裂率和囊胚率显著高于Ionomycin+6-DMAP组(P<0.05);(3)真空蠕动泵抽吸法和刀片切割法获得的卵母细胞总数显著高于注射器抽吸法(P<0.05),而切割法获得的1和2级卵母细胞百分数显著高于其它2种方法(P<0.05)。因此,采用真空蠕动泵抽吸法获得COCS,用较低的粘合交流电压进行半卵粘合,采用A23187+6-DMAP激活法进行融合后的激活能显著提高奶牛手工体细胞克隆效率。 展开更多
关键词 体细胞克隆 手工克隆 无透明带卵母细胞
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利用TALENs和手工克隆技术高效获得GHR基因敲除巴马猪 被引量:9
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作者 李飞达 李勇 +6 位作者 刘欢 张欢欢 刘楚新 张兴举 窦红伟 杨文献 杜玉涛 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期903-911,共9页
DNA编辑技术是基因靶向修饰技术的研究热点,已广泛应用于生物医学和农业研究。然而,传统基因打靶技术存在效率低、成本高、工作量大等缺点,其应用受到了极大的限制。文章利用最近发展起来的新型人工核酸酶——转录激活因子样效应物核酸... DNA编辑技术是基因靶向修饰技术的研究热点,已广泛应用于生物医学和农业研究。然而,传统基因打靶技术存在效率低、成本高、工作量大等缺点,其应用受到了极大的限制。文章利用最近发展起来的新型人工核酸酶——转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALENs)介导的基因组定点修饰技术,通过构建特异识别猪生长激素受体(GHR)基因的TALENs表达载体,共转染巴马胎猪成纤维细胞系,酶切鉴定G418抗性克隆细胞株的基因修饰效率为46.2%,其中2个为双等位基因敲除的克隆细胞株。以双等位基因敲除的克隆细胞株为核供体,利用手工克隆技术制备GHR-KO巴马猪克隆胚,第6 d囊胚率为43.5%,654枚体外发育的囊胚移植6头受体母猪,共获得10头存活的GHR-KO巴马仔猪,其中7头为双等位基因敲除。体重检测结果显示,第20周龄的GHR-KO巴马猪体重仅为对照巴马猪的50%。研究结果表明,TALENs和手工克隆技术能够高效制备出基因敲除大动物。GHR-KO巴马猪的成功制备为研究猪GHR基因生理功能以及人类侏儒症分子机理提供了重要模型,也证明该技术比传统基因打靶和克隆技术具备更简捷、快速、高效,更易于在生物医学和农业基因靶向修饰研究中推广。 展开更多
关键词 基因敲除 TALENs 手工克隆 GHR-KO
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