人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。

溃疡性结肠炎患者结肠黏膜HBD-2和NF-κB及IL-8的表达

目的研究β-防御素2(HBD-2)、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-8(IL-8)在溃疡性结肠炎(UC)患者结肠黏膜中的表达,探讨HBD-2、NF-κB和IL-8在UC发病中的作用和相互关系。方法收集30例UC患者和10例正常结肠黏膜组织,用免疫组织化学法检测HBD-2、NF-κB和IL-8蛋白表达。结果免疫组织化学分析显示,UC组HBD-2、NF-κB和IL-8表达阳性率和表达强度明显高于正常结肠黏膜组(P<0.01);UC轻中重度三组结肠黏膜中HBD-2、NF-κB和IL-8表达阳性率和表达强度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论HBD-2、NF-κB和IL-8水平在UC结肠黏膜组织中明显升高,但与UC病情轻重关系不密切。

信号肽重组HBD2在人肺癌细胞中表达的初步研究

目的 构建高表达人源化β 防御素 2 (HBD2 )表达体系。 方法 构建人pLNCX2 CEA信号肽 HBD2 (成熟肽 )逆转录表达载体 ,DOTAP转染逆转录包装细胞 ,获得含融合基因的侵袭性逆转录病毒 ,再转染人肺癌A5 4 9细胞 ,用免疫印迹法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达。结果 成功构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人肺癌表达体系 ,经WesternBlot检测 ,证实有目的基因表达。

溃疡性结肠炎和肠易激综合征结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达

目的探讨溃疡性结肠炎和肠易激综合征患者结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达及临床意义。方法选择溃疡性结肠炎(UC组)和腹泻型肠易激综合征(腹泻型IBS组)各40例,另选择正常对照组20例,取结肠黏膜标本采用免疫组化SP法进行HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23染色。结果 UC组HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率及表达均显著高于腹泻型IBS组和对照组(P<0.05),UC组不同病情程度之间HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率差异有统计学意义(P<0.05),HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达均与病情程度呈正相关(P<0.05),而腹泻型IBSIL-6和IL-23阳性率及表达与轻度UC差异无统计学意义(P>0.05)。UC患者黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达之间均呈正相关(P<0.05)。结论 HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23在UC结肠黏膜中高表达,参与UC的发生发展过程,而IL-6和IL-23在IBS结肠黏膜中高表达,IBS黏膜炎症改变与轻度UC相似,IBS与UC之间存在相关性。

应用Hapmap数据库分析HBG1-HBD基因间序列单倍型及标签SNP的挑选

目的 HBG1-HBD基因间序列在γ珠蛋白基因表达有重要作用,文中分析中国北京汉族人群HBG1-HBD基因间序列的单倍型并挑选标签SNP(tag SNP)。方法从Hapmap数据库中下载HBG1-HBD基因间序列上中国北京汉族人群的所有SNP数据。应用Haploview 4.0软件对HBG1-HBD基因间序列的SNP位点进行连锁不平衡分析,在此基础上构建HBG1-HBD基因间序列范围的单倍域及单倍型。用MEGA5.10软件对单倍型进行聚类分析,根据SNP之间的r2值挑选出可代表不同类型单倍型的tag SNP。结果在中国北京汉族人群中,HBG1-HBD基因间序列中共有2个单倍域(Block1和Block2),分别有7种和3种单倍型,发生频率均>1%。通过聚类分析将Block1的单倍型分为2组,可通过相互代表的11个tag SNP进行分组,11个SNP依次为:rs3813727、rs10837643、rs4320977、rs4283007、rs4402323、rs4910543、rs4910736、rs2105819、rs968857、rs968856、rs10768687。结论获得了中国北京汉族人群中HBG1-HBD基因间序列的单倍型及tag SNP,为研究HBG1-HBD基因间序列的单倍型与γ珠蛋白基因表达的相关性打下了基础。

寻常型银屑病患者皮损中HBD-2和TNF-α的表达及意义

目的:探讨寻常型银屑病皮损中人β防御素2(HBD-2)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达及其相关性。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测45例寻常型银屑病患者的皮损组织、非皮损组织以及15例正常人皮肤组织中HBD-2 mRNA及TNF-αmRNA的表达。结果:寻常型银屑病皮损组HBD-2 mRNA和TNF-αmRNA表达显著高于非皮损组和正常对照组。在皮损组HBD-2 mRNA与TNF-αmRNA的表达呈正相关,且二者的表达均与患者PASI评分成正相关。结论:HBD-2和TNF-α在寻常型银屑病发病中可能起相互协同的作用,加重了银屑病的炎症反应。

脂质相关膜蛋白体外诱导hBD-2基因表达的研究

目的探讨解脲支原体(UU)的L AMPs对β-防御素表达分泌量与作用时间的研究。方法应用LAMPs体外诱导绒毛膜及胎盘组织hBD-2基因表达,RT-PCR检测hBD-2 mRMA表达。结果不同浓度的LAMPs均能明显诱导绒毛膜及胎盘组织产生hBD-2,相同浓度的LAMPS刺激绒毛膜及胎盘组织12 h,24 h绒毛膜及胎盘组织的HBD-2 mRNA表达量不同。结论绒毛膜及胎盘组织HBD-2 mRNA表达与LAMPs呈明显的剂量依赖性;24 h内绒毛膜及胎盘组织的HBD-2 mRNA表达呈现出时间依赖性。

创伤后感染致多器官功能障碍综合征患者血清β-hBD-2、OPN、pro-ADM和NPt水平的变化

目的:探讨多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平的变化。方法:血清人类β防御素-2(humanβ-defensin-2,β-hBD-2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和新蝶呤(neopterin,NPt)采用酶联免疫分析法(ELISA)测定,肾上腺髓质素前体(pro-adrenomedullin,pro-ADM)检测采用化学免疫发光法。结果:四项血清标志物测定结果分别显示,对照组和确诊时组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著高于正常人组(P<0.05,P<0.01),出院前组β-hBD-2、OPN水平显著高于正常人组,另两项指标均与正常人组比较无显著性差异(P均>0.05);同时确诊时组与对照组比较β-hBD-2、OPN、pro-ADM三项指标水平也显著升高(P<0.05,P<0.01),NPt水平患者组呈略高,但无统计学意义(P>0.05);出院前组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著低于确诊时组(P<0.05,P<0.01)。结论:MODS患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平显著升高,其测定对于临床抗感染治疗提供重要价值。

细菌性阴道病hBD-2 mRNA表达的变化及微生态制剂、中药对其影响

目的研究细菌性阴道病(BV)患者hBD-2 mRNA表达量的变化和微生态制剂、中药提取物对其的影响。方法将BV患者随机分为4组,即健康对照组(n=10)、BV组(n=10)、微生态制剂治疗组(n=8)和中药治疗组(n=7)。采用RT-PCR半定量法,检测阴道组织hBD-2 mRNA的水平。结果与健康对照组相比,BV组、微生态制剂治疗组和中药提取物治疗组hBD-2 mRNA的水平明显升高(P<0.05);微生态制剂治疗组和中药治疗组hBD-2 mRNA的水平平均分别较BV组增高(P<0.05)。结论微生态制剂和中药对BV患者治疗可以使hBD-2 mRNA表达水平上调,提示其在维系正常妇女生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用。

口腔上皮细胞感染白假丝酵母菌后HBD-2蛋白的表达

目的检测人β防御素2(Human beta defensin-2,HBD-2)在口腔上皮细胞中的表达以及白假丝酵母菌对其表达的影响。方法分别以孢子相、菌丝相以及灭活的白假丝酵母菌与KB细胞共同培养6、12、24h后,采用ELISA技术检测各组KB细胞培养液中HBD-2蛋白的表达情况,与对照组进行比较。结果 KB细胞有HBD-2蛋白的基础表达,感染6h后,各实验组与对照组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);感染12h后,孢子组(93.974±6.426)、菌丝组(72.287±2.839)显著高于对照组(37.380±5.663),P<0.01;感染24h后,各实验组表达均高于对照组(P<0.05),但和12h时的表达相比,孢子组(80.851±7.860)、菌丝组(63.932±8.070)出现了下降趋势(P<0.05)。结论 HBD-2在口腔上皮细胞中有基础表达,白假丝酵母菌能诱导其表达上调;白假丝酵母菌对HBD-2的诱导表达只发生在感染的特定时期内,当菌丝进一步侵袭后,HBD-2的表达会逐渐减弱。

防御素HBD-2在口腔白斑病损中表达的研究

目的:探讨口腔白斑(OLK)患者病损中的防御素HBD-2的表达,以分析HBD-2在OLK发病机制与上皮抗感染免疫中的作用。方法:采用免疫组织化学技术(IHC)检测8例OLK病损组织,6例对照组织中HBD-2多肽的表达,并进行分析。结果:HBD-2在所有样本中均出现了阳性胞浆染色,健康口腔黏膜组中HBD-2蛋白为弱阳性染色,与呈强阳性染色的OLK组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健康口腔黏膜组织也有少量HBD-2表达,提示其作为机体先天性免疫的组成部分,在维持口腔黏膜健康上具有一定作用。在OLK的病理过程中HBD-2上调表达而参与了OLK的发病过程,HBD-2有可能与癌前病变有相关性。

人hBD2高表达易分离逆转录表达载体构建

目的 通过现代分子生物学技术 ,构建人pLNCX2 CEA信号肽 EK激酶 hBD2抗菌肽逆转录表达载体 ,为下一步在真核细胞中高表达hBD2奠定基础。方法 PCR法将CEA信号肽、EK激酶识别位点序列、上下游酶切位点及保护性碱基克隆在一个片段上 ,酶切后 ,T4DNA连接酶将此片段定向连接在含hBD2基因片段的 pBluescriptSK质粒上 ,经过反复构建 ,最终完成pLNCX2 CEA EK hBD2 (成熟肽 )融合基因及其载体 ,并采用逆转录病毒法将融合基因整合到宿主细胞中。 结果 构建到逆转录表达载体pLNCX2上的目的基因双酶切后琼脂糖电泳及测序正确 ,RT PCR检测出宿主细胞融合基因表达。结论 成功构建pLNCX2 CEA EK hBD2逆转录表达载体 ,并整合入宿主细胞中表达。

支原体性宫颈炎粘膜HBD-2mRNA的表达

目的探讨支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者人β防御素-2(hBD-2)的表达。方法采用RT-PCR法对10例患者皮损hBD-2mRNA检测,并以10例正常组织做对照。结果正常人和患者均可检测到hBD-2mRNA表达,但支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者表达比明显增多。结论hBD-2参与了支原体性宫颈炎发病过程。

肺心病HBD测定的临床意义

肺心病ＨＢＤ测定的临床意义傅秀华刘健波＊李国华张卿温宇东（内蒙古医学院附属医院０１００５０＊内蒙古自治区医院）本文对慢性肺源性心脏病（下称肺心病）患者不同发病时期及同期正常人的血情α一羟丁酸脱氢酶（ＨＢＤ）进行了测定，进一步探讨其临床意义。１资料与方...

17β-雌二醇对人羊膜细胞β-防御素-4(HBD-4)表达调节的影响

目的探讨17β-雌二醇(E2)对人羊膜细胞内β-防御素-4(HBD-4)基因表达的影响。方法体外培养的人羊膜细胞内添加17β-雌二醇(2n M)培养4h、8h、12h、24h,同时各时间点设相应的对照组(Control组),通过real-time RT-PCR技术检测17β-雌二醇对人羊膜细胞内HBD-4 m RNA的表达变化的影响。结果 17β-雌二醇可上调人羊膜细胞中HBD-4 m RNA的表达(P<0.05)。结论 HBD-4在女性妊娠期羊膜细胞宿主免疫防御中起着重要的作用。

唾液α-HBD活力测定在口腔恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断中的意义

目的:探讨唾液α-HBD活力在口腔恶性肿瘤中的诊断及鉴别诊断中的意义.方法:利用酶速率方法测定88例口腔恶性肿瘤,57例口腔囊肿,52例腮腺多形性腺瘤,62例口腔炎症和57例健康人的血清及唾液中的α-HBD.结果:血清α-HBD在恶性肿瘤组与其它疾病组和对照组比较有极其显著意义(P<0.001).唾液α-HBD在恶性肿瘤组与其它疾病组和对照组比较有极其显著意义(P<0.001).唾液α-HBD与血清α-HBD的比值在恶性肿瘤组与其它疾病组和对照组比较有极其显著意义(P<0.001).唾液α-HBD在囊肿组和腮腺多形性腺瘤组与对照组比较有显著意义(P<0.05).经检验血清α-HBD对口腔恶性肿瘤诊断灵敏度12.5%,对其它疾病的特异度95%,唾液α-HBD对口腔恶性肿瘤的诊断灵敏度91.6%,对其它疾病特异度98%.结论:唾液α-HBD活力的测定对口腔恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断有重要意义.

hBD-3在口腔黏膜下纤维性变癌变过程中的表达研究

目的:探讨人β-防御素-3(hBD-3)在口腔黏膜下纤维性变(OSF)发生及癌变过程中的表达变化及其意义。方法:采用免疫组织化学以及实时荧光定量PCR技术检测10例正常口腔黏膜、22例OSF、13例伴OSF口腔鳞癌组织中hBD-3表达水平。结果:hBD-3蛋白在正常口腔黏膜、OSF、伴OSF口腔鳞癌组织中阳性表达率为40.00%、86.36%、100.00%(P<0.05)。正常口腔黏膜、OSF、伴OSF口腔鳞癌组织中hBD-3 mRNA相对表达量分别为1.06±0.37、1.73±0.21、7.07±0.88(P<0.05)。结论:hBD-3可能与OSF发生及其癌变有关。

HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在红皮病银屑病皮损中的表达

目的研究HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在银屑病红皮病皮损中的表达。方法应用免疫组织化学方法研究HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在银屑病红皮病皮损中的表达,并与健康对照皮肤进行比较,分析HBD-1、HBD-2和NF-κBp65不同组间的表达差异,探讨HBD-2和NF-κBp65共同表达在银屑病红皮病皮损形成中的意义。结果除HBD-1外,另两种因子在银屑病红皮病皮损中的表达均高于正常对照皮肤,差异有统计学意义(P<0.01)。结论HBD-1在正常皮肤组织和红皮病皮损组织中表达差异无统计学意义(P>0.05),证明其为固有表达,与疾病的发展程度无关。HBD-2,NF-κBp65与银屑病红皮病关系密切,高表达的HBD-2,NF-κBp65可能存在相互作用和影响,促进并共同参与银屑病红皮病的发病过程。

2型糖尿病患者口腔念珠菌负荷与唾液HBD-2及HBD-3水平的初步研究

目的:探讨2型糖尿病患者的口腔念珠菌感染情况及其唾液人类β防御素(HBD-2、HBD-3)的表达水平和相互关系。方法:纳入确诊6个月以上近期病情没有变化的2型糖尿病患者39例为实验组及健康者40例为对照组,分别采集两组未刺激全唾液、含漱液,进行口腔念珠菌培养鉴定计数,并采用酶联免疫吸附法检测唾液HBD-2及HBD-3表达水平。结果:实验组中27例(69.2%)念珠菌培养呈阳性,明显高于对照组(20.0%),均以白色念珠菌为主。实验组唾液HBD-2和HBD-3的水平中位数分别为0.045μg/L和8.061μg/L,均明显高于对照组(0.024μg/L和0.832μg/L),两组比较差异均有统计学意义(P<0.05);口腔念珠菌负荷与唾液HBD-3的水平呈正相关(rs=0.245,P<0.05);唾液HBD-2与HBD-3的水平呈正相关(rs=0.370,P<0.01)。结论:2型糖尿病患者的口腔念珠菌负荷普遍较高,分离株以白色念珠菌为主,其唾液中HBD-2、HBD-3的水平均升高,并与口腔念珠菌负荷呈正相关关系。

延龄草总皂苷通过促进人β防御素2(HBD-2)的表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移

目的探讨延龄草总皂苷调控人β防御素2(HBD-2)对HuH-7细胞侵袭和迁移的影响和机制。方法采用(0.5、1.0、2.0、4.0)mg/L延龄草总皂苷处理HuH-7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,TranswellTM小室测定细胞侵袭和迁移能力,Western blot法检测细胞中HBD-2、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9的蛋白水平。将HBD-2小干扰RNA(siRNA)转染至HuH-7细胞中,用延龄草总皂苷处理,实时定量PCR和Western blot法验证干扰效果,TranswellTM法分别检测细胞侵袭和迁移能力。结果除0.5 mg/L延龄草总皂苷对HuH-7细胞增殖无影响外,其他各剂量延龄草总皂苷均可抑制HuH-7细胞增殖。(0.5、1.0)mg/L的延龄草总皂苷处理均可下调细胞MMP2、MMP9蛋白水平、增加HBD-2蛋白水平并抑制细胞侵袭和迁移。HBD-2 siRNA转染可明显降低HuH-7细胞HBD-2水平。下调HBD-2提高延龄草总皂苷处理的HuH-7细胞侵袭和迁移能力并增加细胞MMP2、MMP9蛋白水平。结论延龄草总皂苷通过促进HBD-2表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移。