植物抗病激活蛋白harpin_(Xooc)防治水稻病害的研究

植物抗病激活蛋白harpinXooc由水稻条斑病细菌hrp基因簇中hpa1基因编码。用构建于表达载体pET21a(+)上的hpa1诱导表达产物harpinXooc处理烟草,可激发烟草产生过敏反应,以及激活与烟草抗病信号途径相关的基因PR-1a、hin1和hsr203J的表达;处理水稻后,NPR1、OsPR1a、OsPR1b和PAL被激活。表明harpinXooc蛋白与植物互作后,通过水杨酸信号传导途径激活病程相关蛋白等防卫反应基因的转录表达,从而使植物产生系统获得抗病性。harpinXooc经加工后制成含量达1%的可溶性微颗粒制剂在水稻上进行应用,试验结果显示,harpinXooc蛋白可诱导水稻产生抗病性,防治水稻稻瘟病效果与杀菌剂稻瘟必克(三环唑)相当,防治水稻纹枯病和稻曲病效果与井冈霉素效果相当。对水稻增产的效果主要表现在增加粒实重上,增产达6%以上。

载Harpin_(Xooc)蛋白纳米粒的制备及生物学效应测定

为了评价载HarpinXooc蛋白纳米粒的性状及其在农业领域的应用效果,利用静电聚合原理,以壳聚糖为载体,多聚磷酸钠为交联剂制备载HarpinXooc蛋白纳米粒,测定其粒径、zeta电位、包封率、载药量和释放情况,考察振荡时间对纳米粒的影响。结果显示:载HarpinXooc蛋白纳米粒形态均一,粒径、zeta电位、包封率和载药量分别为(270.0±3.0)nm、(16.5±0.9)mV、62.7%±1.8%和12.6%±2.4%,具有缓释效应,可以诱导烟草产生过敏性反应和更好地促进植物生长。表明:此方法制备条件缓和,工艺简单,包封率较高,制得的载HarpinXooc蛋白纳米粒生物学效应好。

Harpin_(Xooc)蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌RS105菌株中扩增harpinXooc编码基因hrf2,将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游,获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析,在约18kD处有特异目标条带出现。Western blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpinXooc能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinXooc。

水稻白叶枯病菌hrf2基因表达的His-Harpin_(Xooc)蛋白的纯化及分析

利用已构建的工程菌表达His-HarpinXooc蛋白,分析His-HarpinXooc蛋白的纯化条件、产量、等电点和生物活性等。结果表明:1)在使用HisTrap HP Kit进行纯化时,咪唑浓度对于蛋白纯度影响最大,其中150mM咪唑最适合于洗脱His-HarpinXooc蛋白,缓冲液、洗脱次数等对纯化的影响不大;2)每升菌液可获得高纯度的HisHarpinXooc蛋白为20mg,其等电点约为4.7;3)纯化所得His-HarpinXooc蛋白与不含His标签的HarpinXooc生物活性一致,具有Harpin蛋白诱导烟草产生过敏反应的典型特征。此为His-HarpinXooc蛋白的应用奠定基础。