转hpa1_(Xoo)基因棉花活性氧产生及防卫相关基因的表达

采用H2O2和酶活性检测、DAB染色、定量实时PCR等方法研究转hpa1Xoo基因棉花T-34叶组织中的活性氧。结果显示:无病原菌侵染时,T-34和出发品种Z35均未产生活性氧。在接种黄萎病菌分生孢子悬浮液后,与Z35相比,在T-34叶组织中接菌0～8 h H2O2含量变化呈现2个峰值;接菌8 h时PAL和POD酶活性显著增强;DAB染色显示褐红色斑产生;2个防卫基因ghAOX1和hsr203J超表达。这些结果表明,转hpa1Xoo基因棉花为某些防卫基因超水平表达提供了分子基础,使受到病原菌侵染时才诱导产生的高水平活性氧及相关基因表达,并且组成型表达的HarpinXoo赋予转基因棉花对黄萎病菌的抗性。

Harpin_(Xoo)诱导烟草过敏性细胞死亡的细胞及分子特征

HarpinXoo是水稻白叶枯病菌分泌的蛋白质,用harpinXoo注射烟草后20h,可表现过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)。对harpinXoo诱导的烟草叶片用DNA特异染料(DAPI)染色后经荧光显微镜观察发现,烟草细胞在harpinXoo诱导后不同时间表现明显的染色质浓缩;对诱导后的烟草DNA经2%琼脂糖凝胶电泳发现,诱导后12h烟草DNA开始出现弥散的条带,24h后弥散的小片段大量增加;定量RT-PCR检测发现,harpinXoo诱导的烟草HCD早期即有标志基因hin1和hsr203J的诱导表达。这些结果表明,harpinXoo诱导的烟草细胞死亡,是植物的一种主动反应,具有细胞编程死亡的重要特征。

表达全长与截短Harpin_(Xoo)对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105。采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株。通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析。结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达。用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白。抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hrfA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性。

Harpin_(xoo)多克隆抗体制备、鉴定与应用

以纯化harpinxoo蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗harpinxoo蛋白的多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1∶2000,经亲和层析纯化,Westernblot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpinxoo蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpinxoo编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此,兔抗harpinxoo抗体的成功制备,为进一步深入研究harpinxoo的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定基础。

Harpin_(Xoo)诱发烟草过敏反应早期H_2O_2变化及有关基因表达

HarpinXoo是水稻黄单胞细菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae）产生的蛋白类激发子，用harpinXoo注射烟草最早在处理后20h出现肉眼可见的细胞死亡（macro-HR），分别经埃文斯蓝（Evans blue）和台盼兰（Trypan blue）染色观察，发现诱导后4-8h即开始有少量细胞死亡，表明在macro-HR发生前烟草细胞已陆续发生微细胞死亡（micro-HR）；对二氨基联苯胺（diamino benzidine，DAB）染色显示，在烟草细胞死亡早期，伴有H2O2的明显积累；定量RT—PCR法对H2O2代谢相关基因的表达进行了分析，发现harpinXoo诱导后1h编码NADPH氧化酶的基因rboh即开始表达，3～7h表达较强，10h开始减弱，表达趋势与H2O2积累趋势一致；编码交替氧化酶的基因aoxl表达较迟，sodA基因则在诱导后表达减弱。这些基因的不同表达模式说明，它们在harpinXoo诱导的H2O2代谢过程中可能具有不同的作用。

水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达

利用 PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo) Jxo III菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因 hrf A。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种 Pxo86的 Hpa1有 97.2 %的序列一致性 ,比 Hpa1少了一个 - GGG- GG-氨基酸残基序列重复。基因经 Nde I和 Bam HI双酶切后连到含 T7启动子的高表达载体 p ET30 a(+ )上构建重组质粒 p HRF4 ,并转化宿主菌 BL2 1(DE3)产生表达菌株 BL HR4。经过 IPTG诱导之后 ,BL HR4产生一分子量为 15 .6k D的蛋白质。研究表明 ,该蛋白在性质与功能上类似于其它已发现的 harpins,即能够在烟草上引起典型的过敏性反应 ,富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶敏感。因此 ,我们把该蛋白定名为 harpin Xoo。harpin Xoo还具有诱导植物抗病性的功能。

转hpa1_(Xoo)基因棉花悬浮细胞培养及其对黄、枯萎病菌的抗性

为验证对黄萎病菌(Verticllium daliae)、枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)的早期抗性反应,确定了转hpa1Xoo基因棉花株系T-33悬浮细胞适宜的培养条件,并成功获得了T-33和其出发品种Z35的悬浮细胞。以1:20的比例,将T-33悬浮细胞与黄、枯萎菌分生孢子液分别共培养0～24h,发现T-33悬浮细胞在0～6h对两种病原菌的抗性能力较强,悬浮细胞死亡率显著低于Z35(P<0.05〉。与Z35相比,在3h和6h时,针对棉花黄萎病菌T-33悬浮细胞死亡率分别低52%和35%,针对枯萎病菌分别低42%和25%。说明hpa1Xoo编码的harpinXoo表达赋予转基因棉花T-33悬浮细胞系对两种病原菌的抗性高于其出发品种Z35。

Harpin蛋白对冬枣叶片生长和果实发育的影响

对喷施不同浓度HarpinXoo蛋白的冬枣树,进行了叶片生长和果实发育情况的调查与分析。结果表明:不同浓度的HarpinXoo蛋白均对冬枣叶片的叶面积、叶重、叶厚度和果实膨大和增重具有明显的促进作用,其中以20μg/mL或以上浓度的HarpinXoo蛋白促进效果最为显著,继续提高浓度,则增效不明显。

转截短hpa1_(Xoo)基因烟草抗病防御酶活性分析

[目的]探讨转截短hpa1Xoo基因烟草中与抗病性有关的5种防御酶系的活性变化。[方法]以转截短hpa1Xoo基因烟草A6-1和对应的非转基因烟草Xanthi叶片为材料,接种烟草花叶病毒(TMV),测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性。[结果]未接TMV时,转截短hpa1Xoo基因烟草中POD、PPO和CAT酶活性均高于未转基因对照品种,而SOD和PAL活性与未转基因烟草无显著差异。接种TMV后,转截短hpa1Xoo基因烟草中5种防御酶活性均显著增加,且高于未转基因烟草,并维持在一个较高的水平。[结论]截短的hpa1Xoo基因在烟草中表达能显著提高其抗病防御酶活性水平。

Harpin_(xoo)在水稻中表达提高对白叶枯病不同小种抗性

用剪叶接种法测定10个转hrf1基因水稻株系对15个水稻白叶枯病菌小种的抗性。所有的转基因系对JXOⅤ和PXO79小种的抗性与受体对照相比显著提高。RT-PCR结果显示,在转化hrf1基因的抗病水稻中,信号传导基因npr1表达明显增强。表明转hrf1基因水稻可能通过激发水稻中信号传导基因的表达,提高对白叶枯病菌不同小种的抗性。

生长素IAA抑制植物过敏和致病蛋白诱发的超敏反应

以烟草叶片为材料,观察涂抹生长素IAA与注射Harpinxoo蛋白的相互作用的表型变化,并对烟草叶组织内的氧爆发现象进行了定量测定及显微观察,同时,选取EF-1α作为内参基因,通过半定量PCR检测HR标志基因、防卫基因及生长素类相关基因的表达情况。表型试验结果表明,10^(-4)mol·L^(-1)IAA能够抑制harpin_(Xoo)激发的过敏反应,而500μmol·L^(-1)生长素抑制剂三碘苯甲酸(TIBA)能够缓解10^(-4)mol·L^(-1)IAA的抑制作用;氧爆发测定结果与表型一致,IAA同样减少了活性氧(ROS)的积累;半定量PCR结果显示,IAA对HR标志基因hsr203J肪卫基因chia5,PR-1b以及AUX1,ARF8等生长素相关基因均有不同影响。结果表明,IAA可以抑制harpin_(Xoo)蛋白引起的HR,也可以调控氧爆发。

Preparation, Characterization, and Application of Antiharpin_(xoo) Antibody

Polyclonal antiharpinxoo rabbit antibody has been prepared successfully using purified harpinxoo protein as an immunogen. The ELISA titer of the antiserum against harpinxoo was about 1：2 000. Western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expression harpinxoo protein in particular, hrfl, encoding harpinxoo, is an expression in transgenic rice, detected by antiharpinxoo rabbit antibody. The rabbit antibody against harpinxoo can be used to study further about the biological function, harpinxoo localization, and hrfl gene expression in other plants.

转hpa1_(Xoo)基因棉花对棉铃虫全基因组转录谱的影响

【目的】明确转hpa1Xoo棉花抗虫性及其作用机制。【方法】采用生测法和芯片技术分析了转hpa1Xoo棉T-34的抗虫性和harpinXoo表达对棉铃虫全基因组转录谱的影响。【结果】饲喂T-34棉叶的棉铃虫发育明显迟缓,棉铃虫死亡率为90.95%,而饲喂其出发品种(Z35)棉叶的棉铃虫死亡率为12.20%。利用和棉铃虫同属鳞翅目的家蚕的23KOligo探针,以分别饲喂T-34和Z35叶片的棉铃虫RNA为模板,制作了棉铃虫Oligo表达谱芯片,获得了24280个EST数据,从中检测到了2927个基因。在T-34和Z35上饲喂的棉铃虫有872个差异表达基因,其中上调基因328个(ratio>2.0),下调基因544个(ratio<0.5)。872个差异表达基因主要涉及13个生物功能、96个代谢通路。【结论】转hpa1Xoo棉花对棉铃虫的抗性涉及棉铃虫蛋白酶分解和合成、ATP合成等多个生物代谢途径的改变。