PCR——四步两段扩增法分离人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因

引物是决定 PCR 结果的关键。本实验中,引物Ⅰ、Ⅱ虽有26个碱基,但由于其5’端有8个碱基为限制性内切酶的识别序列。所以实际上只有18个碱基与原始模板互补配对。采用标准的 PCR 方法时不能产生理想结果。经采用 PCR——四步两段扩增法从人胎盘cDNA 文库中分离得到—484bp 的 DNA 片段。通过斑点杂交鉴定,结果表明该 DNA 片段为 hbFGF 基因。

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。

重组人融合基因Nm23-H1/HbFGF的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

根据Nm2 3 H1与HbFGFcDNA序列 ,人工合成一段中间核酸序列 ,将它分别与Nm2 3 H1cDNA的上游引物及HbFGFcDNA的下游引物组成两对引物 ,通过PCR(聚合酶链式反应 )构建出融合基因Nm2 3 H1/HbFGF ,将其定向克隆于质粒载体 pBV2 2 0上 ,经诱导 ,SDS PAGE分析 ,表达产物分子量为 34kD ,表达量占菌体总蛋白的14% ,表达产物以包涵体形式存在 ,ELISA和Western印迹表明包涵体具有Nm2 3 H1和HbFGF抗原性 ,然后对包涵体进行变性、复性及纯化处理 ,取纯化产物进行定性和生物活性分析 ,结果证明纯化产物具有Nm2 3 H1和HbFGF的抗原性及生物活性。以上实验为今后进一步研究融合基因Nm2 3 H1/HbFGF在真核细胞中的抑癌、致癌性质打下了基础。

农杆菌介导法将hbFGF基因导入大豆的研究

本研究将hbFGF基因克隆到质粒pCambia1301载体,利用基因重组技术在大豆毛状根中表达。以大豆品种吉农13的子叶节和胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导进行转化。得到的毛状根,通过潮霉素抗性筛选,经PCR检测和Western blot印迹分析,结果表明:阳性毛状根中整合并表达了hbFGF基因。

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆、cDNA5'端修饰及在大肠杆菌中的表达

采用cDNA PCR技术 ,从人胎盘cDNA文库DNA中克隆了人碱性成纤维细胞生长因子 (hbFGF)基因。用PCR突变法对其 5 端序列进行修饰 ,将天然和修饰后的hbFGF基因分别克隆至表达载体 pBV2 2 1,免疫印迹和SDS PAGE结果证明 ,经修饰后的基因在大肠杆菌DH5α中获得了表达 ,表达量占菌体总蛋白的 9%。