Wnt3a转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34^+造血干/祖细胞扩增作用的研究

Wnt信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用.纯化的Wnt3a蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增.通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞.通过共培养对转基因滋养层细胞扩增CD34+造血干/祖细胞的作用进行了研究.实验结果显示,与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的CD34+造血干/祖细胞集落形成能力(CFC)是其(1.55±0.06)倍;混合集落形成能力是其(1.95±0.26)倍;高增殖潜能集落形成能力(HPP-CFC)是其(1.45±0.40)倍;LTC-IC活性是其(3.83±0.86)倍.结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的Wnt3a蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量.

胚胎干细胞向造血干/祖细胞定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞,具有无限增殖潜能,在体外可以向造血细胞分化,有可能为造血干细胞移植和血细胞输注开辟新的来源.此外,ES细胞向造血干/祖细胞的定向诱导分化也为阐明哺乳动物造血发育的细胞和分子机制提供了良好的体外模型.对ES细胞向造血干/祖细胞定向分化的研究进展进行了综述.

外周血造血干细胞最佳采集时机的快速判断方法

目的:探讨一种快速、简捷判断外周血造血干/祖细胞最佳采集时机的方法.方法:使用Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪上的未成熟细胞信息(IMI)通道,对5例异基因外周血造血干细胞移植(Allo-PBSCT)的健康供者,在动员过程中采集外周血进行外周血造血祖细胞(HPC)检测.同时应用流式细胞术(FCM)和集落培养法分别对上述外周血中的CD34+ 细胞、粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)进行分析,动态监测外周血造血干/祖细胞(HSC/HPC)的变化.结果:HPC与CD34+ 细胞及CFU-GM呈良好的正相关,相关系数分别为0.82和0.85.动员后第4天HPC与CD34+ 细胞和CFU-GM同时明显上升,于动员后第5天同时达到高峰,但HPC较CD34+ 细胞和CFU-GM变化幅度大(5～20倍).结论:Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪能快速简便地动态监测外周造血干/祖细胞的变化,为外周血造血干/祖细胞最佳采集时机的判断提供了一种快捷经济的参考方法.

辐射损伤导致造血干/祖细胞衰老的机理研究

目的探讨辐射损伤导致骨髓造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老的可能机制。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为辐照组和假辐照组,辐照组小鼠经6.5 Gy的X射线全身一次性辐照,假辐照组小鼠处理同辐照组,但不辐照。辐照后24 h免疫磁珠分选法分离并计数两组小鼠的Sca-1+造血干/祖细胞细胞(Sca-1+HSC/HPC),流式细胞术检测细胞周期,β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老细胞百分率;混合造血祖细胞集落(CFU-Mix)培养观察分选细胞增殖分化能力,单细胞凝胶电泳(SCGE)检测辐照导致细胞的DNA损伤,RT-PCR检测细胞衰老相关基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA的表达;Westernblot法检测p16INK4a、p21Cip1/Waf1蛋白表达。结果免疫磁性分析法分离纯度的Sca-1+HSC/HPC可达94%,辐照后小鼠每支股骨的Sca-1+HSC/HPC数量急剧下降,细胞出现G1期阻滞;形成CFU-Mix集落数量和形成集落的细胞数明显降低;SA-β-Gal染色阳性率显著增高,彗星实验显示细胞拖尾明显延长;p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA表达明显增强,p16INK4a、p21Cip1/Waf1蛋白的表达水平上调。结论辐射导致HSC/HPC DNA的损伤和衰老相关生物学改变,p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cip1/Waf1信号通路可能起一定作用。

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景:内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。目的:探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。方法:通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。结果与结论:①形态学观察:分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8d左右)、晚期(15d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验:显示8,21d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色:8d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验:在Matrigel基质上15h左右能够生成血管样结构。结果表明:利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。

SOX2及Nestin在Ⅰ型糖尿病大鼠不同时期正中隆起细胞的表达

目的:检测转录因子SOX2及巢蛋白(nestin)在Ⅰ型糖尿病大鼠不同时期正中隆起(median eminence,ME)细胞内的表达及其意义。方法:通过腹腔注射链脲佐菌素的方法,建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型。模型组分为4、8、12周三组,每组10只,共30只;4周正常大鼠作为对照组。用免疫组织化学法检测SOX2及nestin在不同时期的Ⅰ型糖尿病大鼠及对照组大鼠的正中隆起细胞内的表达情况。结果:SOX2主要表达于正中隆起神经元的胞体,nestin主要表达于正中隆起神经元的胞体和突起。SOX2和nestin的表达均随着Ⅰ型糖尿病的时程而逐渐增加;在8周和12周大鼠SOX2在正中隆起的阳性表达百分比分别是73.84±3.29%、69.56±4.44%,与对照组(40.12±0.80%)比较具有显著性差异(P<0.05);而nestin在Ⅰ型糖尿病4、8、12周大鼠正中隆起的阳性表达百分比分别是86.42%±3.38%、81.39%±4.54%、66.30%±3.20%,与对照组(30.21%±1.72%)比较具有显著性差异(P<0.05),且其nestin阳性表达细胞的胞突及分支比对照组多而长。结论:SOX2及nestin在Ⅰ型糖尿病大鼠正中隆起细胞内表达增强,Ⅰ型糖尿病大鼠的血糖升高可能刺激大鼠正中隆起神经干细胞/祖细胞的增殖。

HOX基因A簇对造血干/祖细胞增殖分化的影响及其与白血病的关系

近年来研究证明,HOX基因A簇是造血干/祖细胞增殖分化的主控基因,不仅影响造血干细胞的数量,还参与造血干细胞向红系、粒系、巨核与淋巴系的分化,并可能是导致白血病发病的靶基因。本文简述了HOX基因A簇如何影响造血干/祖细胞的增殖分化,并探讨HOX基因A簇的表观遗传学改变及其与Non-HOX基因和其他融合基因共存,而使HOXa基因与DNA结合并开始发挥调控作用,从而导致白血病。

融合蛋白hJagged1^(ext)-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc,并在毕赤酵母GS115中表达。用RT-PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后,将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC-Fc载体,得到PIC-hJagged1ext-Fc。用MD平板筛选重组子,G418法筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,采用SDS-PAGE分析表达蛋白。结果表明:hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc得到正确表达。结论:成功地构建了hJagged1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究Jagged1在造血干/祖细胞的体外扩增奠定了基础。

亲缘供者脐血加异基因骨髓混合移植治疗骨髓增生异常综合征

目的探讨亲缘供者脐血加异基因骨髓混合移植治疗骨髓增生异常综合征(MDS)的可行性方案和疗效。方法采用有亲缘关系的胞妹脐血加异基因骨髓混合移植治疗MDS女性患儿1例。预处理方案为环磷酰胺、马利兰、抗淋巴细胞球蛋白,以短疗程CD25单抗、环孢菌素A和霉酚酸酯预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果+18d中性粒细胞升至0.5×109/L,+28d白细胞升至4.2×109/L,+42d血小板升至34×109/L。+30、+90d经STR-PCR检测均为完全供者型。无GVHD发生。现患儿移植后健康生存时间达1a4个月。结论有亲缘关系的HLA相合的脐血加异基因骨髓的混合移植治疗MDS是可行的。

肿瘤坏死因子a对辐射损伤小鼠外周血白细胞和骨髓C—kit^+细胞的影响

采用致死性５０Ｃｏ一Ｙ射线辐照的小鼠骨髓型放射损伤模型，测定其外周血白细胞、骨髓单个核细胞，应用流式细胞仪分析骨髓造血干／祖细胞，探讨肿瘤坏死因子ａ（ＴＮＦ。）对骨髓造血功能的辐射防护效应．结果表明：辐射前２４ｈ给予ＴＮＦ。处理组在辐照后第１２天，外周血ＷＢＣ、骨髓单个核细胞数量以及骨髓细胞中Ｃ一ｋｉｔ＋细胞百分率都显著高于未经ＴＮＦ。处理组（Ｐ＜０．０１）。提示ＴＮＦ可以保护机体骨髓造血细胞耐受辐射损伤。

血管干/祖细胞的研究进展

血管壁中的干/祖细胞主要有骨髓间充质干细胞、周细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞4种,它们具有高度的增殖潜能和分化能力,这些细胞可以固定在某些部位也可以进入外周循环中,在出生后的血管发生和损伤后的血管新生中发挥重要的作用。分别介绍了以上几种祖细胞的来源、分布和生物学特性,以及在心血管病理状况下这些祖细胞所受到的影响,并概述了在病理状况下这些血管干/祖细胞之间在分布上和生物学特性方面的复杂性。最后肯定了血管干/祖细胞的作用,并对未来的研究进行了展望。

Th—LICC治疗恶性肿瘤的实验与临床研究

Ｔｈ—ＬＩＣＣ治疗恶性肿瘤的实验与临床研究无锡市江南学院医疗系虞介昌宝晖发展有限公司史庆庆，陈瑞岳无锡市第四人民医院肿瘤科郭正庭，毛永杰，朱寿兴，王震吾摘要＊８为寻求较ＬＡＫ等细胞更为优越的效应细胞作为人体癌肿过继性免疫疗法的细胞来源，选择５～６个月...

骨髓腔内输注人造血干／祖细胞促进NOD-SCID小鼠体内造血功能的恢复

本研究比较经骨髓腔内输注(intra-bone marrow infusion,iBMI)及静脉输注(intravenous infusion,iVI)人脐血(cord blood,CB)造血干/祖细胞(HS/PC)对NOD-SCID受鼠体内造血重建的影响。将纯化的CBCD34+细胞移植到受亚致死剂量照射的NOD-SCID受鼠体内。受鼠随机分为3组:①iBMI组:骨髓腔内输注CD34+细胞5×105/只;②iVI组:尾静脉输注CD34+细胞5×105/只;③阴性对照组:输注PBS缓冲液。于异种移植后第3、5及第8周通过流式细胞术、聚合酶链式反应、免疫组织化学及造血祖细胞集落分析的方法比较人造血系统各系细胞植入率,通过二次移植实验比较NOD-SCID受鼠体内人HS/PC长期造血重建能力。结果表明:移植后第8周,iB-MI组受鼠骨髓、外周血及脾脏中人CD45+细胞比例均显著高于iVI组(p<0.05);iBMI组及iVI组移植的HS/PC均具有多向分化能力;移植后第8周,iBMI组受鼠骨髓中CD45+CD19+细胞、CD45+CD33+细胞、CD45+CD56+细胞及CD45+CD34+细胞比例均显著高于iVI组(p<0.05),CD45+CD14+细胞及CD45+CD41a+细胞比例亦高于iVI组(p>0.05)。iVI组及iBMI组长期存活受鼠的肝脏、脾脏、肺脏、外周血、骨髓细胞中均可检测到人17号染色体α-卫星特异性片段。应用免疫组织化学法在移植后第8周的iBMI组受鼠的脾脏、肝脏和肺脏中均可检出人CD45抗原的表达。iBMI组受鼠的骨髓细胞各系集落总数于移植后第8周显著高于iVI组(p<0.05)。二次移植后第6周,iVI组及iBMI组受鼠的各组织脏器中均可检出人17号染色体α-卫星特异性片段的表达。结论:与iVI相比,经iBMI移植人CBCD34+细胞至NOD-SCID受鼠可以促进HS/PC的造血重建及多向分化,提高植入率。

大麻素Ⅱ型受体激动剂促进小鼠心肌梗死后心脏干/祖细胞增殖的作用

目的:探讨大麻素Ⅱ型受体(CB2)选择性激动剂AM1241对小鼠心肌梗死(MI)模型中心脏干/祖细胞增殖的作用。方法:40只雄性C57BL/6小鼠通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支建立MI模型并随机分为4组,每组10只(n=10):①假手术(Sham)组;②MI组;③MI+CB2受体激动剂AM1241(MI+AM1241)组;④MI+CB2受体激动剂AM1241+CB2受体拮抗剂AM630(MI+AM1241+AM630)组。采用小动物超声系统观察小鼠左室射血分数(LVEF)的变化。用免疫荧光染色法观察MI周边区表达干细胞生长因子受体(c-kit)、干细胞抗原1(Sca-1)的阳性细胞数,实时荧光定量PCR测定MI周边区c-kit、Sca-1和多药耐药蛋白P糖蛋白(MDR1)的表达水平。结果:与MI组相比,MI+AM1241组小鼠7 d和14 d心脏LVEF值显著提高(P<0.01)。免疫荧光染色的结果提示,MI+AM1241组c-kit和Sca-1的表达较MI组增多(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,MI+AM1241组c-kit和Sca-1的基因表达水平明显高于MI组(P<0.05)。同时,CB2受体拮抗剂AM630可阻断AM1241的上述作用。结论:CB2受体激活可促进梗死心肌干/祖细胞的增殖,改善心脏的收缩功能。

B细胞杂交瘤分泌单抗最佳方法探讨

Ｂ细胞杂交瘤分泌单抗最佳方法探讨苏州医学院组织胚胎学教研室张苏苏州市小医院郭卫华本文用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，从腹腔内注入不同剂量Ｂ细胞杂交瘤．以观察其不同的腹水量，探讨Ｂ细胞杂交瘤分泌单抗的最佳实验方案。１细胞培养方法：从液氮中取出冻存的Ｂ细胞杂交瘤细胞...

二氢埃托啡治疗晚期癌性疼痛106例疗效观察

１０６例晚期恶性肿瘤疼痛给予二氢盐酸埃托啡舌下合眼，镇痛效果：Ⅱ级疼痛总有效率为９７．３％，Ⅲ级疼痛者总有效率为９４．１％。未见明显毒副反应。

大鼠门静脉分支残端置管模型构建及细胞移植途径的评价

目的:大鼠肝部分切除模型被广泛的应用于肝脏疾病的研究,随着干细胞治疗肝损伤及护肝药物研究的发展,对大鼠肝损伤模型也提出了很多新的要求。本实验拟在大鼠肝部分切除术的基础上改进以建立大鼠肝断面门静脉分支残端的静脉置管模型,并进行细胞移植实验,对比分析新模型的优劣。方法:60只F344大鼠分为三组。A、B组行行85%肝切除术;C组行85%肝切除术+肝断面门静脉分支残端置管术。术中B组经门静脉注入4×105个表达GFP(green fluorescence protein,GFP)的胎肝干细胞(fetal liver stem/progenitor cells,FLSPCs)。C组经留置导管注射入同等量的FLSPCs,A组注射同等剂量的培养液。72小时取血清,测定肝功能ALT、AST,统计死亡率;取肝脏组织切片观察其修复情况。统计学采用方差分析和LSD-t检验。结果:B、C组F344大鼠72小时肝功指标(ALT、AST)均明显优于A组;B组、C组肝脏组织学的病理损伤的恢复分别较A组快。B、C组间肝功指标无统计学意义。结论:经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs效果等同于经门静脉穿刺途径,且该模型具有可反复、可选时、减少创伤等优点。

无关供者PBSC联合MSC移植治疗重型再生障碍性贫血Ⅱ型的效果观察

目的探讨脐血间充质干细胞（MSC）联合无关供者外周血造血干细胞（URD-PBSC）移植治疗重型再生障碍性贫血（SAA）Ⅱ型的临床效果和安全性。方法回顾性分析2010年3月至2015年6月接受脐血MSC联合URD-PBSC移植的11例SAAⅡ型受者的临床资料。11例受者均经血常规、骨髓细胞形态学、骨髓活检和染色体等检查，明确诊断为SAAⅡ型，原发病诊断到移植的时间中位数为49个月（25-194个月）。所有受者经预处理后进行PBSC联合MSC移植，PBSC移植时输注单个核细胞中位数为11．36×10^8／kg，输注CD34＋细胞中位数为3．46×10^6／kg；PBSC输注24h后输注MSC，输注MSC中位数为1．41×10^6／kg。移植后采用环孢素A（或他克莫司）＋短疗程甲氨蝶呤＋吗替麦考酚酯预防移植物抗宿主病（GVHD）。观察受者移植后造血功能重建情况，移植相关并发症发生情况，以及存活状况。结果移植后，1例受者出现早期移植排斥反应，其余10例受者移植后造血功能均获得重建，未发生输注MSC不良反应。中性粒细胞和血小板植入时间中位数分别为14d（10-23d）和19d（11～38d）。移植后发生I度急性GVHD3例，Ⅲ度急性GVHD1例；1例并发广泛性慢性GVHD。发生肺部真菌感染4例，巨细胞病毒（CMV）血症8例，1例发展为CMV肺炎，EB病毒血症6例，出血性膀胱炎3例。随访时间中位数为26个月（8-74个月），10例受者存活，9例脱离输血，预计5年总体存活率为（90．9±8．7）％，无病存活率为（81．8±11．6）％。结论脐血MSC联合URD-PBSC移植治疗SAAⅡ型是安全、可行的，移植效果良好。