建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞特性高度类似的多能干细胞类型,具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力。将人诱导多能干细胞定向分化成具备功能的肝脏细胞对临床肝脏替代治疗意义重大。目的:建立一种高效的基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案。方法:利用明场显微镜、免疫荧光对人诱导多能干细胞特性进行鉴定。通过转录因子重组蛋白手段时序性调控不同信号通路,即在第0,5,10,15天顺序加入激活素A、成纤维细胞生长因子4/骨形态发生蛋白4、肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M,使多能干细胞经历终末内皮层、肝内胚层、肝母细胞(肝脏前体细胞)最终分化成为有功能的肝脏细胞。利用明场显微镜、实时定量PCR(qPCR)、ELISA动态观察不同阶段形态特征和分子标记物。结果与结论:①所使用的人诱导多能干细胞具备经典的诱导多能干细胞形态特征并且高表达诱导多能干细胞特异标记蛋白(SSEA4、SOX2、OCT4);②人诱导多能干细胞发生了终末内胚层、幼稚肝细胞、肝脏细胞不同阶段形态转变;③qPCR结果显示,随着肝细胞分化进展,诱导多能干细胞特异标记物(OCT4)显著下调,终末内胚层(GCS、CXCR4)和肝脏内胚层标记物(HNF4α、HNF1β)则呈现先升高再下调趋势,而肝脏细胞标记物(CYP34A、ALB)则呈现出逐渐递增趋势;④ELISA结果进一步显示,诱导15 d以后的肝脏细胞开始具备肝特异蛋白(白蛋白、尿素)分泌功能,并且随着时间延长其分泌功能进一步增加;⑤上述结果提示,成功建立人诱导多能干细胞向肝脏细胞定向分化的实验方案,为未来临床肝脏细胞替代治疗提供实验基础。

成体干细胞向肝细胞分化

成体干细胞跨越胚层限制分化为其他胚层来源的细胞,对揭示不同胚层细胞间相互分化的生物学意义和机制具有重要学术价值,并可以为临床细胞移植治疗开辟新的途径,从而成为当前研究的热点之一。综述了近年来肝源性卵圆细胞、成肝细胞、骨髓源干细胞和其他成体干细胞跨越分化为肝细胞的研究现状与进展,以及卵圆细胞、成肝细胞等的分离鉴定,表面标志、生物学特征和跨越分化机制,并对成体干细胞在肝脏疾病细胞治疗上的应用前景作了展望。

缺失mir122抑制斑马鱼肝脏前体细胞向肝细胞分化

作为机体内最大的脏器之一,肝脏对于机体的新陈代谢、解毒作用以及内环境的稳定有着重要的作用。FGF、BMP以及WNT信号通路及众多转录因子形成的基因调节网络精密调控着肝脏的发育,然而小分子RNA在肝脏形成中的功能却所知甚少。近年来的研究发现,mir122在肝细胞中高表达,对于维持肝脏的代谢功能起着至关重要的作用,但是其在肝脏发育中的功能还不清楚。为了深入探讨mir122在斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育中的作用,文章首先检测了mir122在发育过程中的时空表达,发现mir122特异表达在肝脏,并且在肝脏前体细胞向肝细胞分化过程中表达水平显著增高。文章还通过用反义核苷酸Morpholino(MO)敲降mir122的表达,发现敲降mir122对肝脏前体细胞的起源、肝原基的形成以及肝脏前体细胞的增殖没有明显的影响,但是,mir122的缺失导致肝脏前体细胞不能分化为肝细胞。因此,mir122不仅参与了成体肝脏代谢功能的调节,还在肝脏前体细胞向肝细胞分化过程中不可或缺。

胚胎肝干细胞的研究进展

近年来的研究表明在胚胎肝脏中存在大量的肝干细胞,它们在肝脏的发育中起着重要作用,并且受到各种时序性表达基因的调控。几个研究组采用不同的方法,分别从小鼠、大鼠和灵长类动物的胚胎肝脏分离并鉴定了具有双潜能的肝干细胞。就胚胎肝脏的发育、调控机制以及胚胎肝干细胞的分离、鉴定等方面的研究进展作一综述,并对胚胎肝干细胞的应用前景和今后的研究方向作了展望。

白蛋白和角蛋白19双标记胚胎干细胞的建立及其向肝祖细胞的分化

目的建立白蛋白（Alb）和角蛋白19（CK19）双标记的胚胎干细胞系，并探讨其在肝祖细胞分化中的应用。方法构建含有Alb启动子的绿色荧光蛋白载体，并带有新霉素抗性，同时构建由CK19启动子启动红色荧光的载体，带有潮霉素抗性；将构建好的载体线性化后，同时电转胚胎干细胞E14.1，利用新霉素和潮霉素双筛选后，建立双标记基因修饰胚胎干细胞系E14．1—2；通过拟胚体形成及生长因子（骨形态发生蛋白4和碱性成纤维细胞生长因子）刺激的方法诱导产生肝祖细胞，经过流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应检测诱导效率。结果构建了含有Alb启动子启动绿色荧光和CK19启动子启动红色荧光的载体，并证明了Alb和CK19启动子能特异启动各自蛋白的表达}建立了Alb和CK19双标记胚胎细胞系，并证明其具有多能性，显著表达多能性基因八聚体结合转录因子4和阶段特异性胚胎抗原1，在E14．1—2诱导分化22d后通过流式细胞术分选成功得到21．27％Alb和CK19双阳性的肝祖细胞。结论双标记胚胎干细胞的建立可以纯化和定量肝祖细胞，便于改进肝向诱导的方法及研究肝祖细胞特性。

一种肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型的建立

目的建立一种肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型。方法提取E13.5d小鼠胚胎肝细胞，使用标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）分离出肝祖细胞，使用反转录病毒使之组成性表达c-Myc（T58A突变），进而采用脾注射的方法将1×106基因操作后的肝祖细胞通过门脉系统递送到受体鼠肝脏汇管区（实验组，6只）。脾注射相同数量的野生型小鼠肝祖细胞作为对照（对照组，6只）。脾注射8周后处死所有12只小鼠，病理学检查肿瘤发生情况，厚4 μm组织切片行免疫组织化学、免疫荧光检查鉴定肿瘤表型。结果实验组成瘤率66.7%（4/6），对照组成瘤率0%（0/6）；组织学表现符合人类混合型肝细胞-胆管细胞癌特征。免疫组织化学及免疫荧光检查提示肿瘤组织肝细胞标志物白蛋白（ALB）和胆管细胞标志物细胞角蛋白19（K19）的共定位表达。结论脾注射组成性表达c-Myc（T58A突变）肝祖细胞成功诱导肝脏原位混合型肝细胞-胆管细胞癌小鼠模型。

肝脏细胞分化和成熟的分子调控机制

肝脏是重要的代谢调控和药物解毒器官,执行体内多种生理功能。肝脏疾病已经越来越严重地影响着人体健康和生存质量。考虑到临床研究和转化医学的迫切需求,人们必须深入研究肝脏内各种细胞特别是肝实质细胞和胆管细胞的分化成熟过程及分子调控机制。该文概述了肝脏内起源于内胚层的肝实质细胞和胆管分化成熟的发育过程,总结了调控此过程的信号通路和转录因子,并简要介绍了最新技术对于肝脏发育研究的推动作用。这些结果对于人们在体外高效地诱导得到或建立更成熟、结构功能更完善的肝脏样细胞或肝脏类器官以及肝脏疾病的研究与治疗有重要意义。