抗原致敏DC联合CIK在原发性肝癌治疗中的应用

目的:探讨负载自身肝癌裂解物的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养对CIK体外杀伤活性的影响,并观察抗原致敏DC (Ag-DC)联合CIK治疗原发性肝癌后患者的免疫状态、临床疗效及毒副反应。方法:选择24例原发性肝癌患者,分离外周血单个核细胞,其中贴壁细胞经GM-CSF和IL-4诱导产生DC,并负载自体肿瘤裂解物;悬浮细胞经IFN-y、II-2、抗CD3单抗、IL-1α体外诱导产生CIK。将Ag-DC与CIK共培养,观察CIK在体外对肝癌细胞株SMMC-7721的杀伤活性;24例患者接受Ag-DC+CIK的过继免疫治疗,观察疗效。结果:1)Ag-DC与CIK共培养后,CIK体外肿瘤杀伤活性明显提高;2)Ag-DC联合CIK治疗原发性肝癌可明显改善患者细胞免疫功能,提高临床疗效;3)除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论:负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK可作为原发性肝癌常规治疗的有效辅助手段。

靶向下调Cep55表达水平对肝癌细胞增殖能力的影响

目的通过siRNA干扰技术下调中心体相关蛋白Cep55的表达水平,并检测对肝癌HepG2和Hep3B细胞增殖能力的影响,为原发性肝癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法应用Cep55特异性siRNA转染肝癌HepG2和Hep3B细胞,采用Real-time PCR和Western blot方法分别从mRNA和蛋白质水平检测Cep55siRNA对Cep55基因的干扰效果,MTT法检测下调Cep55表达水平时细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布变化。结果与阴性对照组比较,干扰siRNA组Cep55的mRNA及蛋白表达水平均出现明显降低(P<0.05);MTT检测结果显示下调Cep55表达水平能够显著抑制肝癌细胞增殖(P<0.05);流式细胞仪检测显示下调Cep55表达水平能够增加G1期细胞的比例,同时降低G2-M期细胞的比例,出现明显的G2期阻滞。结论下调Cep55表达水平能够显著抑制肝癌细胞的增殖能力,并出现G2期阻滞,提示Cep55可能成为原发性肝癌的有效治疗靶点。

IRE-BP1蛋白与肝癌细胞耐药性发生机制的研究

目的研究IRE-BP 1蛋白与Bel-7402肝癌细胞耐药性的关系。方法根据已知IRE-BP 1蛋白序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测其在敏感Bel-7402细胞株、阿霉素抗性Bel-7402细胞株之间的表达水平差异。结果成功扩增Bel-7402肝癌细胞IRE-BP 1蛋白基因片段,荧光定量PCR表明,IRE-BP 1蛋白基因在阿霉素抗性Bel-7402细胞株的表达量是敏感Bel-7402细胞株的3.57倍。结论 IRE-BP 1蛋白基因在肝癌细胞耐药发生发展机制中存在一定的作用,可为新的耐药性治理备选基因及耐药性检测靶标。

原发性肝细胞癌中干细胞标志物的表达与上皮细胞-间质转化的关系

目的探讨原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中肝干细胞标志物的表达及其与上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系。方法采用免疫组化法检测72例HCC中肝干细胞标志物CK19、EpCAM、CD133、CD90的表达及其与EMT相关蛋白E-cadherin、vimentin和Snail的关系。结果 HCC组织中CK19、EpCAM、CD133、CD90阳性率分别为31.9%(23/72)、40.3%(29/72)、51.4%(37/72)、41.7%(30/72),有镜下癌栓和门静脉癌栓组中CK19、EpCAM、CD133、CD90阳性率均高于无镜下癌栓和无门静脉癌栓组,Ⅲ+Ⅳ期、肿瘤数目多发的HCC中EpCAM、CD133、CD90阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期和单发的HCC;<46岁、组织学Ⅲ+Ⅳ级、血清AFP≥350 ng/ml的HCC中CK19阳性率高于其相应对照组。E-cadherin与其余两种EMT标志物均呈负相关(vimentin:r=-0.572,P=0.004;Snail:r=-0.597,P=0.003),CK19、EpCAM、CD90阳性HCC组中vimentin阳性强度均高于阴性组,CD133阳性HCC组中E-cadherin阳性强度低于CD133阴性组,vimentin、Snail阳性强度均高于CD133阴性组。结论与CK19、EpCAM、CD90相比,CD133阳性的肝癌干细胞与EMT的关系更加密切,CD133可作为同时针对HCC肝干细胞和EMT的治疗靶点。

金丝桃苷抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展

金丝桃苷具有镇痛、抗氧化、抗炎、避免微血栓形成、调节免疫功能、抑制肿瘤细胞生长等多种药理活性。研究表明,金丝桃苷不仅可通过阻滞细胞周期、Ca2+相关的线粒体凋亡途径、胱天蛋白酶介导的细胞凋亡等明显抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,还能促进淋巴细胞的增殖分化、增强淋巴细胞的功能。该文就金丝桃苷抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展予以综述。

亚硝酸钠诱导人肝癌SMMC-7721细胞上皮-间质转化

探讨亚硝酸盐诱导人肝癌SMMC-7721细胞发生上皮-间质转化(EMT)的作用。0.25～25 mmol·L-1亚硝酸钠处理细胞48 h后,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中的TGF-β1、IL-6和IL-8水平,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化,划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞移动和侵袭能力,同时采用Western blotting方法检测EMT相关标记蛋白和p-AKT及下游信号分子的蛋白表达水平。结果表明,亚硝酸钠处理人肝癌细胞48 h,可以引起TGF-β1的分泌显著升高,并呈现剂量依赖性。亚硝酸钠对IL-8及IL-6的分泌也具有一定的增加作用,但不具有剂量依赖性。0.25 mmol·L-1亚硝酸钠作用48 h,诱导细胞形态向间质转化,增强波形蛋白和p-AKT及其下游信号蛋白的表达,抑制E型钙黏素蛋白的表达,促进细胞迁移和侵袭能力。结果提示,亚硝酸钠可能通过促进细胞分泌TGF-β1和IL-8,诱导人肝癌SMMC-7721细胞上皮-间质转化。

低渗HEPES缓冲溶液对腹腔内游离肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨肝癌细胞在低渗溶液中的存活状态,为临床应用温热蒸馏水杀灭腹腔游离肝癌细胞提供理论依据。方法对体外培养的肝癌细胞株Hep3B分别应用渗透压为148 m Osmol/kg和90 m Osmol/kg的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液及0 m Osmol/kg的蒸馏水作用后,运用MTT法及流式细胞仪观察其活性及状态。结果 148 m Osmol/kg及90 m Osmol/kg渗透压的HEPES缓冲溶液对肝癌细胞株Hep3B的杀伤作用不明显,作用30 min后仍有较强的活性;0 m Osmol/kg渗透压的蒸馏水对肝癌细胞有一定的杀伤作用,且随作用时间的延长其杀伤效果增强,作用10 min后才可杀灭肿瘤细胞。结论在肝癌手术中应用温热蒸馏水灌洗需要持续作用10 min以上方可起到杀灭腹腔内游离癌细胞的作用,进而预防术后腹膜种植转移的发生。

Shp2分子在肝癌干细胞中的表达及意义

目的 分析Shp2分子在肝癌干细胞（LCSC）中的表达和对肝癌（HCC）干性调控的意义,进而阐明Shp2调控LCSC的分子机制,探讨其作为HCC治疗靶点及HCC个体化治疗标志物的可行性.方法 采用real-time PCR检测化学治疗抵抗HCC皮下荷瘤中Shp2的表达,进而利用多种分选技术在HCC细胞系富集的干性样本中,通过real-time PCR技术检测Shp2的表达.采用干扰Shp2细胞系,通过Western blot方法明确Shp2对LCSC可能的调控机制.结果 裸鼠体内实验发现,Shp2在化学治疗抵抗HCC细胞皮下荷瘤中表达升高.细胞体外实验中Shp2在富集HCC干性细胞系中表达特异性升高.而在建立的HCC干扰Shp2细胞系中Shp2的表达与β-catenin密切相关,提示Shp2可能通过Wnt/β-catenin通路促进HCC干性形成能力.结论 本研究发现Shp2在HCC细胞中通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进LCSC的扩增.提示Shp2可能作为LCSC的标志物,为临床探索LCSC的靶向治疗提供新的分子靶点和临床转化依据.

P13K／AKT信号通路对肝癌细胞MHCC-97H中CD90＋干样细胞的影响

目的探讨P13K／AKT信号通路对肝癌细胞MHCC-97H中CD90＋干细胞比例及干细胞特性的影响。方法流式细胞术检测MHCC-97H细胞中流式抗体标记的CD90＋细胞含量。P13K／AKT通路抑制剂LY294002处理MHCC-97H细胞后，用流式细胞术分析MHCC-97H细胞中的CD90＋干样细胞含量的变化，Westernblot检测其相关蛋白的表达。平板克隆形成实验检测LY294002对MHCC-97H细胞中CD90＋亚群和CD90-亚群克隆能力的影响。比较不同浓度梯度的CD90＋亚群和CD90亚群在裸鼠皮下成瘤的能力，以及加入LY294002后成瘤能力的变化。免疫组织化学检测CD90＋亚群和CD90-亚群形成的瘤体中干细胞相关抗体CD90、SHP2及AKT和磷酸化-AKT（p-AKT）蛋白在加入抑制剂前后分别的变化情况。对数据进行t检验。结果MHCC-97H细胞中存在CD90＋肝癌干样细胞，经过LY294002处理后，肝癌干样细胞比例由2．98％±0．08％下降为0．78％±0．08％（t=33．680，P〈0．01）。LY294002可以显著降低CD90＋亚群的克隆能力，用药前后分别为95．13％±3．78％和61．82％±7．23％（t=7．617，P〈0．01）；对CD90亚群的克隆能力影响不明显。LY294002能降低CD90＋亚群的成瘤能力和相关肝癌干细胞CD90、SHP2和p-AKT蛋白的表达水平，但对AKT蛋白表达水平影响不大；对CD90-亚群影响不明显。结论MHCC-97H细胞中的CD90＋细胞具有干细胞特性，且依赖P13K／AKT信号通路。

大鼠肝卵圆样细胞恶性转化过程中的基因表达谱分析

目的分析肝卵圆细胞恶性转化过程中基因表达谱的改变，探讨差异基因的意义。方法经直接致癌剂N-甲基-N＇-硝基N-亚硝基胍启动的大鼠肝卵圆细胞样WBF344暴露于过氧化氢，每周1次，重复21次诱发其恶性转化。通过形态学、遗传学和软琼脂克隆形成等实验验证细胞的转化。并应用四甲基偶氮唑盐法检测转化细胞的增殖能力。采用大鼠癌通路发现者功能芯片比较恶性转化过程中正常对照（WB），WB-5（过氧化氢刺激5次），WB21（过氧化氢刺激21次）3组细胞基因表达的差异。结果转化的细胞获得了异倍体核型，具有非停泊依赖生长特性。电镜下转化细胞的细胞器增多，出现缝隙连接和微绒毛等结构。基因表达谱分析显示共有21个基因差异表达，主要参与调节细胞增殖、凋亡、细胞黏附运动等，其中连续上调的有pten，连续下调的有cdknla，而先上调再下调的基因有myc、fos、casp8等。结论细胞增殖和凋亡的异常在卵圆细胞恶性转化过程中起重要作用，而cdknla、pten、myc、los等基因可能是起关键作用的分子。

基质金属蛋白酶9基因在肝癌细胞株、肝细胞肝癌组织中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶9基因(MMP-9)在不同肝癌细胞株系和肝细胞肝癌组织中的表达水平及不同病理时期的临床意义。方法采用SP免疫组织化学染色方法对He PG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H肝癌细胞株及正常肝细胞L02进行检测。同时对42例肝癌组织、42例癌旁组织及20例正常肝组织进行检测,比较MMP-9的表达水平,分析MMP-9在不同肝癌细胞株系和不同肝细胞肝癌组织中的阳性表达水平及肝癌侵袭分子机制。结果正常细胞株(L02)的阳性指数为15,高转移潜能细胞株MHCC97H、MHCC97L的阳性指数分别为560、537,低转移潜能细胞株He PG2、SMMC7721的阳性指数分别为213、320。高转移潜能细胞株的阳性指数高于低转移潜能细胞株及正常细胞株,低转移潜能细胞株的阳性指数高于正常细胞株,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与正常组织比较,肝癌组织及癌旁组织MMP-9的阳性率均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与癌旁组织比较,肝癌组织MMP-9的阳性率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MMP-9在肝癌的侵袭和转移的过程中发挥一定的作用。