新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

目的:探讨新补骨脂异黄酮(NBIF)对肝细胞癌(HCC)Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果:60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖(均P<0.01),光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加(P<0.01);WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达(均P<0.01)。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱(均P<0.01),GSDME-N蛋白表达受到抑制(P<0.01),显微镜下细胞肿胀、吐泡现象几乎消失,LDH释放明显减少(P<0.05)。结论:NBIF能够通过caspase-3/GSDME途径诱导Huh-7细胞发生焦亡,从而抑制HCC细胞的增殖,为HCC的治疗提供一种新思路。

靶向CD24分子3E10增强肝癌HuH-7细胞的化疗敏感度

目的探讨靶向分子CD24单克隆抗体3E10调节肝癌HuH-7细胞对化疗药顺铂敏感度的作用及其分子机制。方法 Western blot和流式细胞术检测抗CD24抗体3E10的特异性;Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡;Real-time PCR和Western blot检测耐药基因和肿瘤干细胞特性基因的表达水平;Western blot检测JAK/STAT3和PI3K/AKT信号通路的活性水平。结果 3E10可有效识别CD24蛋白及HuH-7细胞。3E10显著增强HuH-7细胞对顺铂的敏感度(P<0.05),抑制率由(10.3±3.0)%提高至(34.4±10.8)%。3E10显著降低HuH-7细胞耐药基因ABCB1、ABCB5、ABCC1和肿瘤干性基因NANOG、CD24的表达水平及干性基因β-catenin的磷酸化水平(P<0.05)。3E10显著降低STAT3和AKT的磷酸化水平(P<0.05)。结论靶向CD24分子3E10通过降低HuH-7细胞的耐药性、肿瘤干性和JAK/STAT3、PI3K/AKT信号通路活性来增强HuH-7细胞对化疗药顺铂的敏感度。

延龄草总皂苷通过促进人β防御素2(HBD-2)的表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移

目的探讨延龄草总皂苷调控人β防御素2(HBD-2)对HuH-7细胞侵袭和迁移的影响和机制。方法采用(0.5、1.0、2.0、4.0)mg/L延龄草总皂苷处理HuH-7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,TranswellTM小室测定细胞侵袭和迁移能力,Western blot法检测细胞中HBD-2、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9的蛋白水平。将HBD-2小干扰RNA(siRNA)转染至HuH-7细胞中,用延龄草总皂苷处理,实时定量PCR和Western blot法验证干扰效果,TranswellTM法分别检测细胞侵袭和迁移能力。结果除0.5 mg/L延龄草总皂苷对HuH-7细胞增殖无影响外,其他各剂量延龄草总皂苷均可抑制HuH-7细胞增殖。(0.5、1.0)mg/L的延龄草总皂苷处理均可下调细胞MMP2、MMP9蛋白水平、增加HBD-2蛋白水平并抑制细胞侵袭和迁移。HBD-2 siRNA转染可明显降低HuH-7细胞HBD-2水平。下调HBD-2提高延龄草总皂苷处理的HuH-7细胞侵袭和迁移能力并增加细胞MMP2、MMP9蛋白水平。结论延龄草总皂苷通过促进HBD-2表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移。

低浓度二甲双胍对肝癌细胞株Huh-7迁移、侵袭能力的影响及其机制

目的观察低浓度二甲双胍对肝癌(HCC)细胞株Huh-7细胞迁移、侵袭能力的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的Huh-7细胞,分别加入1、0 mmol/L二甲双胍干预(分别记为观察组和对照组),采用划痕实验评估二甲双胍对细胞迁移能力的影响,细胞侵袭实验评估二甲双胍对细胞侵袭能力的影响,葡萄糖代谢芯片评估二甲双胍对细胞PDK4 mRNA表达的影响,免疫印迹实验分析二甲双胍对细胞PDK4蛋白表达的影响。结果观察组干预24、48 h细胞迁移率分别为40.14%±2.40%、84.02%±3.85%,对照组分别为100.00%±0.00%、170.10±7.48%,两组比较,P均<0.05。观察组干预24 h细胞侵袭数为(183.20±17.13)个,对照组为(403.60±17.31)个,两组比较,P<0.05。观察组及对照组PDK4 mRNA相对表达量分别为1±0.01、1.84±0.01,两组比较,P<0.05。观察组及对照组PDK4蛋白相对表达量分别为0.53±0.01、0.44±0.01,两组比较,P<0.05。结论二甲双胍能抑制HCC Huh-7细胞的迁移和侵袭,机制可能与其可调控PDK4蛋白表达有关。

保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞的作用及机制研究

目的探讨保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用及机制,为临床应用与推广提供科学的理论及实验数据。方法体外培养人肝癌Huh-7细胞,实验分为四组:对照组(生理盐水)、保肝蒙药Ⅰ号组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组、保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组。分别采用MTT法、流式细胞术和Q-PCR技术观察药物干涉后对肝癌细胞增殖的抑制作用,对肝癌细胞凋亡、细胞周期阻滞和相关基因表达的影响。结果 5-Fu组、保肝蒙药Ⅰ号(4 mg/m L)组和保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组对Huh-7肝癌细胞增殖抑制率分别达到67.70%、73.67%和75.35%。保肝蒙药Ⅰ号组单独作用于Huh-7肝癌细胞以及保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组联合作用,细胞的凋亡率均显示增加(P<0.05)。与对照组比较,保肝蒙药Ⅰ号组和5-Fu组分别作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞G_0/G_1期比率明显增加(P<0.05);然而,保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞S期比率明显增加(P<0.05)。保肝蒙药Ⅰ号组对凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达具有调控作用,能上调细胞色素C的表达。结论保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖有显著的抑制作用,其机制与细胞周期阻滞及影响肿瘤细胞凋亡相关基因的表达相关。研究成果将对阐明临床应用的保肝蒙药Ⅰ号治疗肝癌的机制及推广应用有重要意义。

KIF2C对肝细胞癌细胞恶性生物学行为和人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的:探究驱动蛋白-13家族2C(KIF2C)对肝细胞癌(HCC)细胞增殖、侵袭和迁移以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成的影响,为HCC治疗提供潜在靶点。方法:用数据库数据分析KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中的表达及其与血管生成相关因子(VEGFR2和HIF-1α)表达的相关性,常规培养人正常肝细胞QSG-7701、HUVEC和HCC细胞Huh-7、Hep3B2.1-7,用Lipofectamine 3000转染试剂将sh-NC和sh-KIF2C转染至Huh-7、Hep3B2.1-7细胞,qPCR检测各组QSG-7701、Huh-7和Hep3B2.1-7细胞中KIF2C mRNA的表达,WB法检测各组细胞中KIF2C蛋白的表达,细胞克隆形成实验检测敲低KIF2C对Hep3B2.1-7和Huh-7细胞克隆形成的影响,小管生成实验检测敲低KIF2C表达的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的条件培养液对HUVEC血管生成能力的影响。结果:数据库分析结果显示,KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中均呈高表达(均P<0.01),用qPCR和WB法检测人HCC中KIF2C mRNA和蛋白的表达水平,结果显示其mRNA和蛋白在各HCC细胞中也呈高表达(均P<0.01),与数据库数据分析结果相符。数据库数据分析还显示,KIF2C与HCC组织中VEGFR2、HIF-1α的表达水平呈正相关(P<0.05或P<0.01)。成功构建了稳定低表达KIF2C的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞(均P<0.01),敲低KIF2C表达均可明显抑制Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的增殖能力(均P<0.01)、侵袭和迁移能力(均P<0.01),敲低KIF2C表达的HCC细胞条件培养液均可显著抑制体外HUVEC的血管生成能力(P<0.05或P<0.01)。结论:KIF2C可促进Huh-7和Hep3B2.1-7细胞增殖、侵袭和迁移以及HUVEC血管生成的能力,提示KIF2C可能是治疗HCC的潜在靶点。

应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究

目的:使用C-to-G碱基编辑器(CGBE)Td-CGBE-NG靶向敲除huh-7肝癌细胞系前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因,以CBE(AncBE4max)为参照,评价Td-CGBE-NG对该基因的敲除效果。方法:使用引入终止密码子的策略敲除huh-7肝癌细胞系PCSK9基因。构建碱基编辑器Td-CGBE-NG和AncBE4max,构建重组质粒sg386和sg555,将Td-CGBE-NG和sg386,AncBE4max和sg555分别共转染huh-7细胞,实现c.1447C>G和c.1953C>T的转换,在两位点引入终止密码子S386X(TGA)和Q555X(TAG),使用sanger测序和T载体克隆验证编辑效率;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCSK9基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:sanger测序和T载体克隆结果显示,Td-CGBE-NG和AncBE4max的编辑效率分别为c.1447C>G 33%和c.1953C>T 25%;RT-qPCR结果显示,Td-CGBE-NG使PCSK9 mRNA的表达量降低(t=17.29,P<0.0001);Western blot结果表明,两组huh-7细胞蛋白表达量均明显下降(AncBE4max:t=5.57,P<0.01;Td-CGBE-NG:t=4.912,P<0.01)。结论:Td-CGBE-NG可以有效敲除huh-7肝癌细胞系的PCSK9基因,抑制该基因mRNA和蛋白的表达,为后续Td-CGBE-NG的应用奠定基础。

过表达CXCR7介导AKT信号通路对人肝细胞癌细胞新血管生成的调控机制

目的研究过表达CXCR7通过AKT信号通路诱导人肝细胞癌细胞新血管生成的作用机制。方法(1)检测CXCR7基因在SMMC-7721,Huh-7,HepG2,BEL-7402和MHCC-97H五种肝细胞癌细胞中的表达量,选取最适合癌细胞株进行转染实验;(2)转染Lenti-CXCR7-GFP慢病毒到BEL-7402细胞,观察转染后细胞形态,获得纯Lenti-CXCR7-GFP转染的BEL-7402细胞液;(3)检测CXCR7、p-AKT(phospho-AKT)、AKT、MMP2和MMP9表达量;(4)qRT-PCR法检测肝细胞癌中CXCR7与VEGFmRNA表达;(5)通过AKT通路抑制剂LY294002处理BEL-7402细胞,检测4组(Lenti-CXCR7-GFP-BEL-7402+DMEM处理组、Lenti-CXCR7-GFP-BEL-7402+LY294002处理组、Lenti-GFP-BEL-7402+DMEM处理组、Lenti-GFP-BEL-7402+LY294002处理组)细胞中CXCR7与VEGF蛋白表达;(6)采用鸡胚绒毛尿囊膜法检测BEL-7402肿瘤血管生成情况。结果(1)Western blot实验结果表明正常肝细胞中CXCR7基因表达量很少,5株癌细胞中BEL-7402的CXCR7表达量相对较低,所以我们选择BEL-7402肝癌细胞株进行转染实验;(2)用倒置荧光显微镜观察细胞形态,可见大部分细胞均呈绿色荧光显色,表明Lenti-CXCR7-GFP转染到BEL-7402细胞后细胞活性较好,转染已经成功;(3)AKT通路相关蛋白表达量检测结果表明CXCR7、p-AKT,MMP2和MMP9蛋白表达量结果显示实验组显著高于对照组;(4)转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402肝癌细胞中CXCR7基因处于过表达状态,VEGFmRNA表达量显著高于对照组(P<0.05);(5)转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402细胞+LY294002处理组中VEGF蛋白表达量比正常转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402细胞组明显下降(P<0.05)。通过单纯Lenti-GFP转染的细胞(对照组)与Lenti-GFP转染+LY294002(处理组)相比,VEGF表达水变化较小(P>0.05);(6)接种BEL-7402细胞后,鸡胚绒毛尿囊膜中血管密度增加形成血管瘤,CAM增厚,结构不规则,血管加粗且呈放射状分布,Lenti-CXCR7-GFP转染BEL-7402肝细胞后,鸡胚绒毛尿囊膜中血管密度增加,增强了血管生成能力。结论肝细胞癌中CXCR7的过表达促进新血管生成的作用是经由激活了肝细胞癌中的AKT信号通路而诱导产生实现,CXCR7可能是AKT信号通路的一个重要激活剂。

miR-660-5p通过靶向调控ING3影响肝癌细胞迁移和侵袭

目的探究ING3在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用及其与miR-660-5p的关系。方法评估3种肝癌细胞Huh-7、MHCC97H和HepG2中ING3的表达,根据Real-time PCR结果选择ING3表达适中的Huh-7细胞进行后续实验。使用ING3过表达载体和siRNA转染Huh-7细胞,通过MTT、细胞划痕和Transwell侵袭实验评估ING3在Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。通过Western blot实验检测PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的表达,验证在Huh-7细胞中干扰或过表达ING3对PI3K/AKT信号通路的影响;随后采用双荧光素酶报告实验验证miR-660-5p和ING3的靶向作用;最后通过挽救实验,即设置miR-660-5p inhibitor和ING3 siRNA共转染,验证miR-660-5p在肝癌中对ING3的调控作用。结果与空载体对照组相比,ING3过表达组肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭能力均下调(P均<0.05);与Inhibitor NC组相比,siRNA ING3组细胞增殖、迁移和侵袭能力均上调(P均<0.05)。双荧光素酶报告实验证明miR-660-5p与ING3存在靶向调控关系(P<0.01),且挽救实验进一步证明,肝癌细胞共转染miR-660-5p inhibitor与siRNA ING3后能部分逆转miR-660-5p的作用。结论在肝癌细胞中抑制miR-660-5p可促进ING3的表达,从而减弱肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

PNPLA3基因 I148M多态性对肝癌细胞株Huh-7细胞周期的影响

目的 探讨PNPLA3基因I148M多态性对人肝癌细胞株Huh-7细胞周期的影响及其相关机制. 方法 利用构建成功的稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株,以空载体细胞为对照,流式细胞术检测转染的Huh-7细胞周期,Western blot方法检测细胞周期调节因子Cyclin D1、p53的蛋白表达情况.荧光定量PCR检测Cyclin D1、p53的mRNA表达情况.两组间比较用独立样本t检验. 结果 三组间各细胞周期细胞所占比例的两两比较显示野生型组细胞周期G1期（58.53％±0.35％）,G2/M期（24.87％±0.60％）,S期（16.60％±0.26％）参数与对照组对应各期（G1期59.27％±0.15％;G2/M期24.23％±0.31％;S期16.50％±0.26％）之间差异无统计学意义（P＞ 0.05）;突变型组与野生型组相比,G1期细胞比例减少（突变型G1期38.37％±0.21％,P＜0.05）,S期与G2/M期细胞比例相应增加（突变型S期27.47％±0.35％,G2/M期34.17％±0.15％,P＜0.05）.与对照组相比,突变型组的p53 mRNA相对表达量明显上调（对照组1.06±0.41,突变型组6.54±0.34;P＜0.05）;野生型组p53 mRNA相对表达量差异无统计学意义（1.66±0.30,P＞0.05）.Cyclin D1 mRNA各组中的相对表达量差异均无统计学意义（对照组1.00±0.10,野生型组1.06±0.03,突变型1.11±0.04;P＞0.05）.结论 PNPLA3基因I148M多态性通过上调p53的表达引起Huh-7细胞周期紊乱.

瘦素促进人肝癌细胞侵袭性生长的体外研究

目的:观察瘦素(leptin)对人肝癌细胞Huh 7生长和侵袭的影响,并初步探讨其可能的机制。方法:培养人肝癌细胞Huh 7,在不同浓度的瘦素作用不同时间后,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期;用Transwell小室检测瘦素(100ng/mL)作用24h后对Huh 7细胞侵袭能力的影响,并用实时荧光定量PCR分析瘦素对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA的影响。结果:瘦素可以促进Huh 7细胞的增殖(P<0.05或P<0.01),存在一定的剂量依赖性;流式细胞仪检测结果显示,瘦素能明显降低G_0/G_1期细胞比例并提高S期细胞比例(P<0.05或P<0.01);瘦素(100ng/mL)处理24h后,Huh 7细胞穿透聚碳酸酯膜的能力比对照组显著增强(P<0.01);实时荧光定量PCR检测发现,MMP-2和MMP-9 mRNA表达量分别增高至对照组的4.25和2.73倍(P<0.01)。结论:瘦素可以明显提高人肝癌细胞Huh 7的增殖和侵袭力,瘦素提高其侵袭力的作用机制可能与MMP水平的增高有关。

NK-104在人肝癌细胞系对TNF-α诱导的NF-κB基因活性的影响

背景与目的:炎症与癌症的发生已经引起学者们的关注。Nuclear factor KappaB因子(NF-κB)是炎症过程中关键的基因之一,在细胞的生存及恶化的演变过程中起着重要的调节作用,能够被各种外界刺激因素激活。本研究探讨第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA,HMG-CoA)还原酶抑制剂NK-104在人肝癌细胞系对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB基因活性的影响。方法:以肝癌细胞系Huh7为靶细胞,WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;以Western blot法检测NK-104对TNF-α诱导的细胞核NF-κB基因活性的表达及IκBα的表达;ELISA法检测NK-104对IL-8产物的影响。结果:NK-104(0.1μmol/L)单独治疗组对NF-кB基因的表达无明显影响,TNF-α(1ng/ml)能够明显提高NF-кB基因的表达呈1.8倍左右,与NK-104共同作用后,能够显著抑制它的表达(P<0.01)。而细胞内IκBα的表达差异无显著性(P>0.05);NK-104可显著降低NF-кB激活后炎性细胞因子IL-8产物的分泌。结论:NK-104在人肝癌细胞系对TNF-α诱导的NF-κB基因活性及其IL-8产物的分泌具有明显的抑制作用,为临床治疗肝癌提供一定的实验依据。

肝癌细胞蛋白磷酸酶2A催化亚基在过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导急慢性肝癌细胞损伤模型中的表达及其对肝癌细胞的影响

目的探讨过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导肝癌细胞急慢性损伤后蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2A)的表达情况。方法采用不同浓度的过氧化氢(0、50、100、200、400、800μmol/L)或黄曲霉毒素B1(0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L)诱导肝癌细胞(HepG2/Huh-7细胞)2、4、6、8和24、48 h后,倒置显微镜观察细胞形态,刃天青实验检测肝癌细胞活性,Western Blot检测去甲基化PP2A催化亚基C(PP2Ac)和总PP2Ac蛋白的表达情况。两组间比较用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析和析因设计资料两因素方差分析。结果HepG2/Huh-7细胞对过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导敏感,随着过氧化氢和AFB1浓度升高或孵育时间延长,细胞形态发生变化,数量减少。在2、4、6和8 h时间段,100μmol/L及以上浓度的过氧化氢诱导HepG2/Huh-7细胞后,随着过氧化氢浓度的升高,HepG2/Huh-7细胞活性逐渐下降,不同浓度过氧化氢与对照组(0μmol/L)比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。在4个不同时间段,两株细胞IC50用两因素方差分析比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。在24、48 h时间段,2.5μmol/L及以上浓度黄曲霉毒素B1诱导HepG2/Huh-7细胞后,随着浓度的升高,HepG2/Huh-7细胞活性逐渐下降,不同黄曲霉毒素B1浓度与对照组(0μmol/L)相比,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。在两个不同时间段,两株细胞IC50用两因素方差分析比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。用200μmol/L过氧化氢诱导HepG22 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-5.553、-2.990,P值分别为0.005、0.040);400μmol/L过氧化氢诱导Huh-7细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为0.073、-5.149,P值分别为0.002、0.007)。用10μmol/L黄曲霉毒素B1诱导HepG2细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-4.561、-5.788,P值分别为0.010、0.004);20μmol/L黄曲霉毒素B1诱导Huh-7细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-5.120、-6.144,P值分别为0.007、0.004)。结论过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导肝癌细胞急慢性损伤后细胞形态发生变化,细胞活性降低,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达升高。