Chk1基因沉默增强姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的敏感性

背景与目的:Chk1和Chk2有望成为肿瘤放化疗增敏的新靶点,然而,Chk1/2能否作为姜黄素治疗肿瘤的增敏靶点却很少有研究报道。本研究旨在探讨Chk1/2小干扰RNA(siRNA)对姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的影响,评价其作为姜黄素治疗肝癌增敏靶点的有效性。方法:Western blot方法检测姜黄素对肝癌细胞Huh7中细胞周期检测点信号通路蛋白的影响;RT-PCR和Western blot方法检测Chk1/2siRNA对Chk1/2mRNA和蛋白的沉默效果;DAPI核染色法分别检测Chk1/2siRNA抑制Chk1/2表达后姜黄素诱导Huh7细胞凋亡的情况;流式细胞术检测Chk1/2表达被沉默后姜黄素对Huh7细胞周期的影响。结果:姜黄素明显抑制细胞周期检测点信号通路蛋白Chk1(S317),Cdc25C(S216)和Cdk1(Y15)蛋白的磷酸化水平;与si-NC转染组相比,Chk1/2siRNA使细胞中Chkl和Chk2mRNA水平分别下降了95%和60%,蛋白水平分别下降了92%和55%(P<0.01);抑制Chk1使姜黄素诱导的细胞凋亡率由(21.3±1.8)%上升到(29.5±2.6)%(P<0.05),抑制Chk2并无此作用;Chk1/2siRNA对姜黄素处理后的Huh7细胞周期均无明显影响。结论:Chk1siRNA能有效提高姜黄素诱导Huh7细胞的凋亡率,提示Chk1可能作为姜黄素治疗肝癌的有效增敏靶点。

叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞miR-122表达及IGF-1R信号通路的调控作用

目的观察叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh7细胞miR-122表达及胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路的影响,探讨其抗肝癌作用机制。方法采用反义寡核苷酸技术(siRNA)建立miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞株(anti-miR-122-Huh7细胞)。体外培养Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞,分别设置对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.0 mg·mL^-1)和低剂量组(1.5 mg·mL^-1)。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测2种细胞增殖;流式细胞术检测anti-miR-122-Huh7细胞调亡;采用qRT-PCR法和Western Blot法分别检测miR-122及其转录因子C/EBPα、靶基因IGF-1R及下游AKT3、KRAS、ERK1和CyclinG1基因表达。结果与肝癌Huh7细胞比较,anti-miR-122-Huh7细胞miR-122的表达显著下降、靶基因IGF-1R蛋白表达明显升高(P<0.05),miR-122表达抑制肝癌Huh7细胞构建成功。与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于肝癌Huh7细胞后,可以显著上调miR-122的表达(P<0.05),并下调IGF-1R mRNA的表达(P<0.05);叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组均可显著抑制Huh7、anti-miR-122-Huh7细胞的增殖(P<0.05),且对anti-miR-122-Huh7细胞抑制作用更为明显(与Huh7细胞比较,P<0.05)。与对照组比较,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组作用于anti-miR-122-Huh7细胞后,细胞晚期凋亡率及总凋亡率均显著升高(P<0.05);高剂量组的miR-122表达及miR-122的上游转录因子C/EBPα的mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05);高、低剂量组的IGF-1R及下游AKT3、KRAS、CyclinG1基因的mRNA、蛋白表达均显著下调(P<0.05),且ERK1蛋白表达亦明显下调(P<0.05)。结论叶下珠复方Ⅱ号可能通过提高miR-122的表达,抑制IGF-1R信号通路活化,从而抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进其凋亡。

异银杏素对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响

目的:研究异银杏素对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响。方法:不同浓度的异银杏素对Huh7细胞处理不同的时间,采用CCK-8法检测细胞增殖,划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果:异银杏素浓度依赖性地抑制Huh7细胞的增殖(IC50=16.68μmol/L,48 h;IC50=15.42μmol/L,96 h)。经异银杏素处理24 h后的细胞,划痕愈合率和细胞侵袭率显著降低;流式细胞术结果显示,12.5μmol/L异银杏素实验组细胞阻滞在G0/G1期,且各实验组细胞凋亡率均有所上升。结论:异银杏素能抑制Huh7细胞增殖、迁移和侵袭,并改变细胞周期分布,诱导细胞凋亡。

远华蟾蜍精抑制人肝癌Huh7细胞增殖及诱导细胞死亡

目的探讨远华蟾蜍精(telocinobufagin,TBG)抑制人肝癌Huh7细胞增殖及诱导细胞死亡的机制。方法采用CCK-8法检测TBG对肝癌Huh7细胞增殖的影响,免疫荧光和流式细胞术检测远华蟾蜍精对Huh7细胞死亡的影响,Western-blot检测TBG对肝癌Huh7细胞焦亡和凋亡蛋白的影响。结果TBG可以显著抑制肝癌Huh7细胞的增殖,呈浓度-时间依赖性(P<0.001);TBG显著诱导肝癌Huh7细胞凋亡和细胞焦亡(P<0.001)。结论TBG可通过诱导肝癌Huh7细胞凋亡和焦亡抑制肝癌细胞的增殖。

银翘解毒软胶囊体外抑制人冠状病毒229E及其介导的炎症的研究

目的探究银翘解毒软胶囊(YQ)对人冠状病毒229E(HCoV-229E)的体外抑制作用。方法通过经典的体外细胞模型分析银翘解毒软胶囊的体外毒性及对HCoV-229E的抑制作用;通过空斑实验验证银翘解毒软胶囊对HCoV-229E的抑制作用;应用实时定量PCR法分析银翘解毒软胶囊对HCoV-229E介异的炎症因子表达水平的影响。结果银翘解毒软胶囊对人肝癌细胞的50%毒性浓度为(3 315±131)μg·mL^(-1),对HCoV-229E的50%抑制浓度为(361.9±36)μg·mL^(-1),选择指数为9.16。空斑实验表明银翘解毒软胶囊2 mg·mL^(-1)几乎可完全抑制病毒复制(P<0.001)。银翘解毒软胶囊在2 mg·mL^(-1)浓度作用下,可明显抑制由冠状病毒HCoV-229E感染介导的炎症因子如趋化因子(C-C基元)配体5(CCL-5,P<0.001)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1,P<0.001)、白细胞介素6(IL-6,P<0.001)、白细胞介素8(IL-8,P<0.001)和肿瘤坏死因子α(TNF-α,P<0.001)核酸的升高。结论体外实验显示银翘解毒软胶囊可抑制人冠状病毒HCoV-229E的复制及其介导的炎症反应,具有作为抗冠状病毒药物的开发价值。

大黄素对人肝癌Huh7细胞的凋亡作用及机制研究

目的研究大黄素对人肝癌Huh7细胞的凋亡作用及分子机制。方法培养肝癌Huh7细胞,1、3、10、30、100μmol/L的大黄素处理24 h,5-氟尿嘧啶(5-FU)作为阳性药,MTT法检测细胞存活率;30μmol/L大黄素处理细胞0、3、6、24 h,光学显微镜观察细胞形态变化;Annexin V-FITC/PI双染法与流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果大黄素显著抑制Huh7细胞生长且呈浓度依赖性,其IC50值为11.55μmol/L。30μmol/L大黄素处理细胞,随着药物作用时间的增加,细胞明显固缩和凝聚,大量细胞脱离培养皿底部;细胞凋亡明显;p-Akt、Bcl-2蛋白表达量减少,cleaved caspase-3蛋白表达量增加。结论大黄素通过Akt信号途径诱导肝癌Huh7细胞凋亡。

靶向p21的shRNA对姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的影响

探讨靶向p21的shRNA对姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡的影响。采用RT-PCR和Western blotting方法检测姜黄素对肝癌细胞Huh7中p21 mRNA和蛋白表达的影响;构建针对p21的shRNA干扰表达载体pSi-p21;采用RT-PCR和Western blotting方法检测pSi-p21对p21 mRNA和蛋白表达的影响;通过DAPI核染色法检测pSi-p21抑制p21表达后姜黄素诱导Huh7细胞的凋亡情况。实验结果显示,姜黄素能明显上调p21 mRNA和蛋白的表达水平。干扰载体pSi-p21可以显著降低p21的表达水平和抑制姜黄素诱导肝癌细胞Huh7凋亡。研究结果提示,姜黄素通过上调p21的表达进而诱导肝癌细胞Huh7发生凋亡。

不同浓度槲皮素对人肝癌细胞株Hep3B、Huh7细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度槲皮素对人肝癌细胞株Hep3B、Huh7凋亡的影响。方法将人肝癌细胞株Hep3B、Huh7分别种植于96孔板中,每孔2×105个细胞,设6个复孔,放入37℃、5%CO2培养箱中培养至贴壁生长。加入不同浓度槲皮素(0、10、50、100μM)干预,48 h后用胰蛋白酶收集细胞,利用流式细胞仪分析不同浓度槲皮素干预下Hep3B、Huh7细胞周期分布情况。结果槲皮素浓度为10、50、100μM时,Hep3B和Huh7在Pre-G0期随浓度增加所占百分比升高,并且以100μM时所占百分比最高(P<0.01),而在不同浓度槲皮素干预下的G1期、S期和G2/M期时Hep3B和Huh7所占百分比显著降低(P<0.01)。结论槲皮素可诱导人肝癌细胞株Hep3B、Huh7的凋亡,并且以浓度为100μM时效果最好。