基于异源策略的黄曲霉毒素B_1酶联免疫(ELISA)分析方法的建立

为提高黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)酶联免疫分析灵敏度,建立了基于异源策略的间接竞争酶联免疫分析(IC-ELISA)方法。首先采用黄曲霉毒素B1与羟基乙酸(glycolic acid,GA)进行衍生化反应,生成缩醛(AFB2-GA),即AFB1半抗原,质谱鉴定结果为ESI-MS:388.07[M+H]+,表明半抗原合成成功。然后采用活泼酯法,将AFB1半抗原羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基经脱水反应实现化学共价偶联,得到AFB1人工抗原AFB2-GA-BSA。紫外扫描结果表明人工抗原AFB1特征吸收峰与BSA和AFB1的特征吸收峰有明显差异,BSA与黄曲霉毒素B1成功偶联,摩尔结合比分别为8.45∶1。最后将黄曲霉毒素B1人工抗原AFB2-GA-BSA作为包被原,利用黄曲霉毒素B1高特异性3G1抗体,建立了基于异源策略的IC-ELISA方法。利用该方法测定了3G1抗体的灵敏度,检测灵敏度达到0.3ng/m L,比同源ELISA方法检测灵敏度(1.6ng/m L)提高了81.25%,并将方法应用于花生中黄曲霉毒素的实际检测。测定结果与高效液相色谱法结果进行比对,结果符合曲线y=1.044 4x+0.090 2,R2=0.975 1,说明该方法能满足花生中黄曲霉毒素快速筛查的测定准确度的要求。

结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免—BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察。方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS阴性对照组,DNA初免—BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次。PBS组3次均注射PBS溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫。末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平。结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1∶120、1∶160、1∶80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05)。结论:联合DNA疫苗初免—BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

IL-12联合结核杆菌DNA疫苗初免-BCG加强免疫的免疫效果观察

目的研究并比较IL-12联合结核分枝杆菌(TB)DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗初免-BCG加强免疫的应答效果。方法将小鼠随机分成PBS阴性对照组和4组免疫组:BCG组、DNA(Ag85A和ESAT-6)初免-BCG异源加强组、DNA+IL-12初免-BCG异源加强组和DNA初免-BCG+IL-12异源加强组。末次免疫后4、6、8周分别测定血清总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验(流式细胞仪检测),测定脾细胞培养上清中IFN-γ分泌水平,并检测小鼠脾脏淋巴细胞表型。结果4组免疫组体外经TB纯蛋白衍生物(TB-PPD)刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,且抗体水平在末次免疫后4～8周逐渐增加,4组平均效价为1∶80,1∶120、1∶160、1∶160,各组抗体水平增加无明显差异(P>0.05);小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,4组免疫组均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平均明显强于BCG,DNA/BCG组(P<0.05),但DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组间差异不明显;4组免疫组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞较PBS组有较大升高(P<0.05),且DNA+IL-12/BCG和DNA/BCG+IL-12组CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比大于BCG以及DNA/BCG组(P<0.05)。结论IL-12联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略较BCG免疫以及单纯的DNA疫苗初免-BCG加强免疫能在小鼠体内诱导更强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。

基于文献的毕赤酵母研究趋势分析

毕赤酵母作为一种表达外源蛋白以及积累代谢中间物的细胞工厂已经得到广泛应用。文献检索是分析毕赤酵母研究的重要手段。该文基于Web of Science数据库分析了毕赤酵母的文献数量变化、来源国家分布等,以阐明我国有关毕赤酵母的研究状况。同时,展望了毕赤酵母外源基因表达技术、发酵策略、过氧化物酶体吞噬等新研究动向。

多尺度分解双寻优策略SPCNN的果园苹果异源图像融合模型

针对单一的自然场景图像信息不能满足准确识别果实和精准定位目标的要求,提出一种多尺度分解双寻优策略简化脉冲耦合神经网络(Simplified Pulse Coupled Neural Network,SPCNN)的飞行时间(Time of Flight,ToF)与可见光果园苹果图像融合模型。对SPCNN模型引入带参数优化的双寻优策略,对非下采样轮廓波变换(Nonsubsampled Contourlet Transform,NSCT)融合规则进行改进。模型包括配准模块、编码区、多尺度分解模块、单目标SPCNN融合模型、多目标SPCNN融合模型、解码区。模型改进了SPCNN模型的参数优化方式以及迭代次数,模型自适应点火次数较低,在3~7次左右,具有点火次数低、自适应分割、效率高的优点。中光15:00时段点火识别成功率达到了100.00%,点火分割时间达到最低91.91s。与其他融合模型比较,模型在强光12:00、中光15:00、弱光18:20、19:00时段融合图像识别成功率达到100.00%;融合时间低于SPCNN模型,达到最低92.68 s。模型识别精度最优达到了100.00%,融合耗时最低达到了92.68 s,模型大小较SPCNN低一个数量级,可补充和完善图像层次融合理论和方法。

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测(indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)方法。结果:在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%~111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论:成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。

环糊精葡萄糖基转移酶高效异源表达研究进展

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase,CGTase)酶法合成环糊精是目前生产环糊精的主要方法。本文介绍了用于生产环糊精葡萄糖基转移酶的几种工程菌株:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母,其中大肠杆菌是目前应用最广泛的用于表达CGTase的表达系统。除此之外,本文还总结了高效表达环糊精葡萄糖基转移酶的有效策略:选择合适的表达载体、启动子以及信号肽,以及密码子优化和分子伴侣共表达,以期为在相关CGTase研究领域开展研究提供参考。

大肠杆菌体系外源蛋白表达速度的调控策略

介绍和评价了目前针对大肠杆菌体系外源蛋白表达的转录、翻译和折叠阶段的各种表达速度调控策略.根据现有各类调控策略的作用阶段、特点及优缺点,提出对蛋白表达各步骤分别调节,从而获得合适的整体表达速度以优化表达效果,提高大肠杆菌体系外源蛋白生产效率和产品质量,进一步提高其适用性和经济性.

密码子优化策略在异源蛋白表达中的应用

酶在医疗和生物药物方面有着广泛的应用,不仅可以用来治疗各种疾病,还在临床诊断和人体健康等方面有着重要的影响。利用微生物来表达异源蛋白已经成为获取酶最简单快速的方法。为获得高浓度和高质量的异源蛋白,常用的方法是对基因序列进行密码子优化。传统的密码子优化策略主要基于密码子偏好性和GC含量,忽略了翻译动力学和代谢水平等复杂多样的变化因素。文中从基因水平、转录水平、翻译水平、翻译后水平以及代谢水平等多方面考虑出发,提供了一个较为全面的密码子优化策略,主要包括密码子偏好性、密码子协调性、密码子敏感性、调整基因序列结构以及一些其他影响因素。同时对每种策略的内容、理论支持以及应用范围等方面作了全面的总结,并将各策略的优缺点进行了系统的比较,为异源蛋白表达提供了全方位、多层次、多选择的优化策略,也为酶工业和生物药物等方面提供参考。

染色体DNA琼脂糖包埋法辅助的ExoCET技术克隆放线菌天然产物生物合成基因簇

【目的】本研究旨在通过将琼脂糖包埋染色体DNA的方法与ExoCET重组技术相结合,建立放线菌天然产物生物合成基因簇的捕获方法。然后将克隆基因簇导入通用底盘宿主中,实现目标生物合成基因簇的异源表达。【方法】首先,利用低熔点琼脂糖包埋技术制备菌株的染色体基因组总DNA,再用限制性内切酶消化含有染色体DNA的琼脂块,获得线性化的DNA样品;然后利用ExoCET重组技术,以p15A线性载体片段将目标基因簇线性片段进行捕获;再通过PCR-targeting的方法向目标质粒中引入所需的接合转移DNA元件。接着,将改造质粒通过接合转移导入到Streptomyces coelicolor M1252宿主中,获得不同的重组菌株。最后,对不同的菌株进行发酵并提取化合物,最后进行活性检测以及质谱检测。【结果】通过该方法,从菌株S.lincolnensis NRR2936中成功获得了林可霉素生物合成基因簇(lmb-BGC),从菌株Nonomuraea nitratireducens WYY166^(T)中克隆得到了2个核糖体肽类化合物的生物合成基因簇(nioblantin,niob-BGC和nitblantin,nitb-BGC),并实现了lmb-BGC在天蓝色链霉菌M1252中的成功表达。【结论】本研究通过将低熔点琼脂糖包埋技术与ExoCET重组技术进行合理整合,定向克隆得到了林可霉素以及2个新颖的羊毛硫肽类化合物的生物合成基因簇。然后,分别对重组质粒改造后,在天蓝色链霉菌M1252宿主中进行表达,分别获得重组菌株MJX01、MJX02和MJX04。最后,利用质谱以及活性测试的手段对发酵提取物进行了检测,确定了林可霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1252中成功表达。本研究为通过基因簇克隆和异源表达发掘新化合物奠定了基础。

枯草芽孢杆菌表达和分泌异源蛋白的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于基础研究和工业生产的重要模式菌株,具有无致病性、蛋白分泌能力强、遗传背景清晰等多种优势,是生产异源蛋白的理想宿主。目前已有诸多异源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现表达和分泌,其中包括淀粉酶、β-半乳糖苷酶和蛋白酶等有价值的工业酶。本文从异源蛋白表达和分泌的关键步骤出发,总结了枯草芽孢杆菌生产异源蛋白的传统策略和最新技术。除此之外,分析了当前研究存在的瓶颈并对如何提高异源蛋白产量提出了新的建议和策略。