甲醇酵母表达系统高拷贝数整合型表达载体的构建

以甲醇酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）表达系统的ＹＩｐ型表达载体ｐＪＦ５１为基础，通过引入宿主来源的一个ｒＤＮＡ随机顺序和由ＳＶ４０早期启动子控制的Ｇ４１８抗性基因（ｎｅｏ）及对野生型标记基因Ｈｐｌｅｕ２启动子大部分上游序列的缺失，构建了一个高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ。有关转化、筛选和拷贝分析等试验结果表明，由ｐＭＩＲＨ可产生含高拷贝数载体的转化子，并可通过由ｌｅｕ２＋筛选和Ｇ４１８抗性筛选所组成的二级筛选方法富集这些含高拷贝数载体的转化子。有关完整ＤＮＡ和消化ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析结果进一步表明，上述高拷贝数的载体以串联重复排列的方式整合于宿主基因组。

可诱导高拷贝的正交琥珀抑制性tRNA筛选质粒的构建

为筛选获得对大肠杆菌氨酰合成酶具有高度正交性的琥珀抑制tRNA,建立了一种基于可诱导高拷贝质粒的筛选系统。利用乳糖操纵子对oriL复制子进行调控,有IPTG存在时使其携带的琥珀抑制性tRNA大量转录。正交性不高的琥珀抑制性tRNA大量转录时导致宿主菌死亡,只有携带高正交性的琥珀抑制性tRNA的克隆可以存活,从而达到筛选目的。利用这一筛选质粒,构建了琥珀抑制性tRNA突变文库,并进行了筛选,获得了与大肠杆菌氨酰tRNA合成酶具有高度正交性的突变体,并利用含琥珀抑制突变的半乳糖苷酶突变体进行了验证,证实利用可诱导高拷贝的筛选质粒可筛选出高正交性的琥珀抑制性tRNA突变体。

La(Ⅲ)对质粒pUC18复制拷贝数的影响

稀土应用的日益增长将会对生物的遗传产生深远的影响。生物的遗传离不开DNA的复制,由于染色体DNA非常巨大和复杂,难以直接研究稀土离子对其复制的影响。本研究以细菌染色体之外的遗传因子——质粒为对象,研究L a3+对质粒DNA复制拷贝数的影响。结果表明:在不同浓度L a3+存在下,质粒在宿主细胞中复制的拷贝数不同;因培养时间相同,因此质粒在宿主细胞中复制的平均速率不同。由于质粒复制与染色体DNA复制使用相同的酶系,因而可初步推断不同浓度的L a3+对染色体DNA复制的平均速率有同样的影响。

稀土元素La(Ⅲ)对质粒pUC18复制速度的影响

稀土应用的日益增长将会对生物的遗传产生深远的影响 .生物的遗传离不开DNA的复制 ,由于染色体DNA非常巨大和复杂 ,难以直接研究稀土离子对其复制的影响 .以细菌染色体之外的遗传因子———质粒为对象 ,研究La3+对质粒DNA复制速度的影响 .结果表明 :在不同浓度La3+存在下 ,质粒在宿主细胞中复制的速度不同 ;由于质粒复制与染色体DNA复制使用相同的酶系 。

下调bla表达提高pcDNA3·1+在重组菌中的稳定性

高拷贝质粒pcDNA3·1+在鼠伤寒沙门氏菌SL7207中不稳定。通过去除pcDNA3·1+中氨苄青霉素抗性基因(bla基因)的启动子序列,仅保留其核糖体结合位点,构建了新质粒pmcDNA3·1+。SL7207(pmcDNA3·1+)在含与不含氨苄青霉素的培养基中均能稳定保留其质粒。SL7207(pmcDNA3·1+)的β-内酰胺酶活力明显低于SL7207(pcDNA3·1+),且接种SL7207(pmcDNA3·1+)的液体培养基中的氨苄青霉素不易被降解。腹腔接种小鼠7d后,脾脏中SL7207(pmcDNA3·1+)的质粒稳定性仍保持在95%以上,而SL7207(pcDNA3·1+)免疫后第3d99%丢失质粒。所以,通过降低bla基因的表达水平,为解决高拷贝质粒在沙门氏菌中的稳定性问题提供了新方法。

不依赖IPTG诱导产木糖醇大肠杆菌工程菌的构建

该研究采用分子生物学技术构建不依赖异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产木糖醇的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌,并研究启动子、质粒拷贝数、诱导剂IPTG的添加、基因xylA和xylB的敲除以及木糖含量对工程菌发酵产木糖醇的影响。结果表明,当转速为200 r/min时,E.coli AI07/pWYZ-1(启动子为lacP)的木糖醇产量是E.coli AI07/pAGI02(启动子为pflB-p6)的1.8倍;E.coli AI07/pWYZ-2(中拷贝质粒pBR322)的木糖醇产量高于E.coli AI07/pWYZ-1(高拷贝质粒pUC19),分别为19.56 g/L、7.90 g/L;是否添加诱导剂IPTG对E.coli AI07/pWYZ-2产木糖醇影响不大,且在发酵96 h时,木糖醇产量极显著高于E.coli AI05/pWYZ-2(P<0.01),其在不添加IPTG的条件下,当木糖初始质量浓度为80 g/L,发酵时间为108 h时,木糖醇产量达48.7 g/L。

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点。因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键。研究中,从酿酒酵母基因组中扩增得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体p NTS2K中,得到4种复制整合型载体(p NTS2K-ARS304、p NTS2K-ARS315、p NTS2K-ARS735、p NTS2KARS1512)。经电转化后,4种转化子(36a(p NTS2K-ARS304)、36a(p NTS2K-ARS315)、36a(p NTS2K-ARS735)、36a(p NTS2K-ARS1512))都能在含有300μg/m L G418的YPD平板上生长。然而,只有转化子36a(p NTS2KARS315)能在含有500μg/m L G418的YPD液体培养基里较快生长。经过G418耐受性检测后,36a(p NTS2KARS315)仍能在含有1 mg/m L G418的YPD培养基中很好地生长。此外,通过质粒p NTS2K-ARS315表达荧光蛋白,其表达效果高于普通商业质粒。实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制,其中ARS315复制能力最强。因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础。