Detection of High Pathogenicity Island(HPI) in Pathogenic Escherichia coli of Mink by PCR

[Objective] The paper was to analyze the carrying status of high pathogenicity island （HPI） in pathogenic Escherichia coli of mink. [Method] Eight strains of E. coli were isolated from dead mink, and conducted pathogenicity test of artificial infection. The carrying status of HPI （irp2, fyuA） was detected by PCR. [Result] Eight strains of E. coli were pathogenic E. coli, and the carrying rate of HPI （irp2, fyuA） was 100%, positively correlated with the pathogenicity. [Conclusion] The results lay a foundation for further exploring the pathogenic mechanism of E. coli..

牦牛腹泻源大肠杆菌O抗原血清型鉴定与HPI相关基因检测

为了研究牦牛腹泻源大肠杆菌的O抗原血清型及强毒力岛(HPI)相关基因的携带情况,试验对采自西藏山南地区某牦牛养殖场的80份腹泻牦牛肛拭子样本进行细菌的分离与鉴定,并对分离的大肠杆菌菌株进行F17毒力因子检测、O抗原血清型鉴定及HPI相关基因irp3、irp5、irp2、ybtA、fyuA、irp8、ans_-tRNA_-intB检测。结果表明:从80份肛拭子样本共分离到28株大肠杆菌。在28株分离菌株中,有5株菌株携带F17毒力因子,共有17种O抗原血清型。其中O158检出率最高,为50.00%(14/28);O125、O119、O146检出率较高,分别为39.28%(11/28)、39.28%(11/28)、35.71%(10/28);而O127、O18检出率最低,均为14.29%(4/28)。HPI相关基因irp3、irp5、irp2、ybtA、fyuA、irp8、ans_-tRNA_-intB的阳性率分别为35.71%(10/28)、28.57%(8/28)、32.14%(9/28)、32.14%(9/28)、28.57%(8/28)、28.57%(8/28)和28.57%(8/28)。说明分离到的牦牛腹泻源大肠杆菌优势血清型为O158,且存在携带HPI相关基因的情况。

E.coli HPI通过NLRP3/caspase-1信号通路诱导细胞焦亡而促进肠道炎症

目的:探究大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)强毒力岛(high-pathogenicity island,HPI)对细胞焦亡及肠道炎症的影响。方法:用含HPI的E.coli株(HPI+)、HPI缺失的E.coli株(△HPI)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分别处理昆明小鼠和IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞)。测定小鼠肠道乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、IgA表达和分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)含量;HE和TUNEL染色观察肠道损伤;RT-qPCR、免疫组织化学染色和Western blot检测小鼠肠组织和IPEC-J2细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/caspase-1信号通路关键调控点的表达;ELISA检测小鼠血清和IPEC-J2细胞培养上清液中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18含量;共聚焦显微镜观察NLRP3与caspase-1的共定位。siRNA沉默IPEC-J2细胞的NLRP3,验证NLRP3在E.coli HPI感染中的关键调控功能。结果:相对于△HPI感染,E.coli HPI显著降低小鼠肠道SOD活性,增加IgA+B细胞,并促进LDH的释放和SIgA的分泌;ELISA、HE染色和TUNEL染色结果显示,E.coli HPI促进了小鼠肠道上皮细胞DNA断裂、组织损伤和炎症;Western blot结果显示,相对于△HPI,E.coli HPI感染使得小鼠肠道消皮素D的N端片段(gasdermin D N-terminal fragment,GSDMD-N)蛋白水平显著升高;RT-qPCR和免疫组织化学染色结果显示,E.coli HPI显著促进了小鼠肠道和IPEC-J2细胞中NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达,IL-1β和IL-18分泌增加;共聚焦显微镜观察发现,相对于△HPI感染,E.coli HPI显著促进了NLRP3炎症小体的组装,使得NLRP3与caspase-1发生共定位;此外,在NLRP3沉默的IPEC-J2细胞中观察到E.coli HPI诱导的细胞炎症、细胞损伤及NLRP3/caspase-1信号通路的激活被缓解。结论:HPI的存在增强了E.coli的毒力水平,促进肠道炎症;NLRP3/caspase-1信号通路调控的细胞焦亡参与了E.coli HPI诱导的肠道损伤。

致病性大肠杆菌HPI毒力岛及其水平转移的研究进展

致病性大肠杆菌作为肠杆菌科成员和人兽共患病病原体之一,在一定条件下可通过多种途径引起人和动物感染并引发不同的大肠杆菌病病型。由于致病性大肠杆菌的血清型和毒力因子众多、耐药趋势严峻、存在生物被膜等因素导致大肠杆菌病的流行趋势复杂且疫苗研发困难,给国内外的畜禽养殖业带来一定的经济损失。高致病性岛(high-pathogenicity island,HPI)最早发现于耶尔森菌,被证实是其毒力表型所必需的基因组岛,为强毒力岛。由于细菌的水平转移机制让该毒力岛在其他肠杆菌科中被广泛检出。其中HPI毒力岛也在致病性大肠杆菌如肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)、产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)等中被大量检出,被证实影响致病性大肠杆菌毒力,参与致病性大肠杆菌铁元素摄取和介导宿主免疫反应等。为进一步了解HPI毒力岛在致病性大肠杆菌中的铁元素调控机理、致病特性、介导的细胞免疫反应和水平转移途径,现从HPI毒力岛结构、如何调控耶尔森菌素铁载体、HPI毒力岛致病性及调控细胞免疫反应、HPI毒力岛的水平转移进行概述,以期望为大肠杆菌的致病机理及大肠杆菌病的防控提供帮助。

断奶仔猪源大肠杆菌LEE及HPI毒力岛的检测

应用Duplex_PCR方法,对240株断奶仔猪源大肠杆菌分离株的LEE毒力岛的eaeA基因和耶尔森菌强毒力岛核心区的irp2基因进行了检测,并对HPI毒力岛的fyuA基因及其在大肠杆菌染色体中的插入位置进行了分析,以及随机选取部分PCR产物进行了克隆和序列分析。结果表明:其中29株(12.08%)为LEE+HPI+,39株(16.25%)为LEE+,11株(4.58%)为HPI+;另外还发现:不同病例来源的分离株之间,两种毒力岛的携带率不同;在断奶仔猪腹泻源分离株中,29株(20.71%)为LEE+HPI+,22株(15.71%)为LEE+,9株(6.43%)为HPI+;断奶仔猪水肿病源分离株中,仅5株(6.58%)为LEE+,2株(2.63%)为HPI+,未发现LEE+HPI+菌株;断奶仔猪水肿病并发腹泻源分离株中,仅12株(50%)为LEE+,未发现HPI+及LEE+HPI+菌株。本实验克隆的eaeA(425bp)与已发表序列完全一致,irp2(280bp)f、yuA(948bp)、asn_tRNA_intB(1391bp)均与已发表的序列高度同源,同源性分别在98.2%、98.3%、95.8%以上;40株LEE+HPI+或HPI+分离株中,29株(72.5%)为fyuA+,且其HPI毒力岛位于大肠杆菌染色体asn_tRNA位点。

禽源性大肠杆菌HPI irp2基因序列的扩增及比较

从养殖场发病家禽中分离到多株禽源性大肠杆菌(E scherich ia coli),用其中Y ZG 040515、NTLFC 040402、CHZ031016菌株提取细菌高致病性染色体DNA,根据耶尔森菌高致病性毒力岛(HP I)irp 2基因设计引物,用PCR扩增出278 bp基因片段。将PCR产物克隆到pGEM-T-easy中,经E coRⅠ酶切鉴定为阳性者进行序列测定。结果表明:该基因片段与G eneB ank中发布的耶尔森菌HP I irp 2基因的同源性高达98%以上,证明禽源性大肠杆菌中具有耶尔森菌毒力岛HP I基因序列,结合临床发病情况和流行病学,提示该毒力岛与日趋严重的家禽大肠杆菌病可能有一定的相关性。

我国部分地区猪源大肠杆菌LEE和HPI毒力岛相关基因的检测

目的采用PCR方法检测我国江苏等9个省市部分地区分离的1 007株猪源大肠杆菌中肠细胞脱落位点毒力岛(LEE)和强毒力岛(HPI)。方法对LEE毒力岛检测其核心区的ler和eaeA基因,对HPI毒力岛检测其irp2和fyuA基因。同时对LEE和/或HPI阳性大肠杆菌进行了O血清型的鉴定。结果在分离的猪源大肠杆菌中,LEE毒力岛基因检测结果为:2.2%(22/1 007)的菌株ler和eaeA基因的扩增阳性,0.5%(5/100 7)的菌株eaeA阳性。HPI毒力岛基因检测结果为:10.6%(107/1 007)的菌株irp2和fruA基因扩增阳性,2.1%(21/1007)的菌株irp2阳性;其中有2株irp2和ler基因扩增阳性,有3株irp2、ler和eaeA基因扩增阳性,1株irp2f、yuA、ler和eaeA基因扩增都为阳性;在128个HPI阳性分离株中,O93和O107血清型菌株分别占定型菌株的15.7%(13/83)和12.0%(10/83)。结论2.7%的猪源大肠杆菌携带LEE,12.7%的菌株携带耶尔森菌HPI,O93和O107为猪源HPI大肠杆菌常见血清型。

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10^(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。

吉林省部分地区犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定与强毒力岛(HPI)相关序列分析

为了研究吉林省犊牛腹泻病病原,试验采用灭菌棉拭子无菌采集吉林省部分地区奶牛场发生典型腹泻症状的64份犊牛直肠拭子样品进行病原菌的分离、理化、16S r DNA鉴定,O因子血清型鉴定,致病性分析以及强毒力岛(HPI)核心区irp2、fyu A和ybt A基因携带情况检测。结果表明:试验共分离出致病性大肠杆菌39株,irp2基因阳性率85%(33/39),即33株大肠杆菌HPI阳性。HPI阳性分离株中检出fyu A基因10株,阳性率为30%(10/33);ybt A基因6株,阳性率为18%(6/33)。共有15株大肠杆菌分离株对小鼠有较高的致病性。39株菌共覆盖8种血清型,其中O14为优势血清型,占定型菌株的56%。说明HPI在犊牛腹泻大肠杆菌中广泛分布且HPI的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关。

大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。

携带HPI毒力岛的大肠杆菌的毒力基因分析

目的检测分离自腹泻病人、家禽粪便和食品标本的携带HPI毒力岛的大肠杆菌携带其他致病性相关基因组岛的情况。方法运用PCR和DNA打点杂交方法。结果在被检测的82株大肠杆菌中,志贺氏菌属的Shi-2岛检出率为62.2%(51/82);大肠杆菌O157:H7的8个O岛中,OI55和OI140的检出率为57.3%(47/82),且二者协同存在;OI28的检出率为35.4%(29/82),OI115的检出率为68.3%(56/82),OI144的检出率为9.8%(8/82),OI43和OI122则均未检出。该82株大肠杆菌中78株携带至少2个毒力岛,如编码RTX的OI28岛、编码III型分泌系统的OI115岛以及编码粘附素的OI144岛,另外还有4株菌携带7个基因岛,20株菌携带6个基因岛。结论一些和细菌致病性有关的基因组岛在肠道大肠杆菌中广泛存在,其中一部分有可能是致病性的,提示基因横向转移在致病性大肠杆菌进化过程中具有重要意义。

部分ESIEC菌株存在耶尔森氏菌HPI毒力岛

本文应用小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力岛HPI上的irp2、fyuA基因和大肠杆菌染色体上asnT -tRNA位点检测的引物 ,对 43株肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌 (ESIEC)进行了PCR检测。发现约 34 9%的菌株irp2、fyuA引物扩增阳性 ,而这部分菌株asnT -tRNA位点引物扩增为阴性 ,证实ESIEC中确有耶尔森氏菌毒力岛的irp2、fyuA基因 ,并且也在染色体上asnT -tRNA位点插入。

缺失耶尔森菌HPI irp6基因EAggEC的构建

目的 构建小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛irp6重组自杀质粒 ,并应用其构建EAggEC上该基因的缺失株。方法 根据已知小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛irp6基因序列 ,设计PCR引物 ,扩增并克隆了irp6结构基因 ,在体外进行精确突变后 ,插入氯霉素抗性基因。再将含氯霉素的irp6缺失基因亚克隆入自杀质粒 pKNG1 0 1中 ,构建成irp6基因重组自杀质粒 pKH6 ,并以肠粘附聚集性大肠杆菌EAggEC 1 7 2为出发菌株 ,通过体内同源重组 ,置换其irp6基因。结果 经接合转移和同源重组 ,利用蔗糖抗性筛选 ,pKH6上的同源序列有效的置换了EAggEC 1 7 2的irp6基因。结论 以小肠结肠炎耶尔森菌为靶构建的irp6基因重组自杀质粒成功的缺失了EAggEC 1 7 2的irp6基因 ,获得了携带耶尔森菌强毒力岛的EAggEC 1 7 2irp6基因缺失株EAG6 。

耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体的构建

目的构建耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,为进一步构建HPI全岛缺失株打下基础。方法根据已知小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因序列设计PCR引物,扩增并克隆irp8结构基因,作为同源重组的一侧序列,以irp5的部分序列作为同源重组的一侧序列,并将之克隆入同一载体,中间插入有卡那霉素(Km)基因(kan)抗性标记。以自杀质粒pCVD442为载体,构建了含有irp8基因和irp5部分序列的缺失突变载体pCO85。结果构建的突变载体经酶切及PCR鉴定克隆片段大小与预期一致。结论成功构建了致耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,这个以小肠结肠炎耶尔森菌为靶序列构建的重组自杀质粒可应用于肠杆菌科及其他菌属HPI毒力岛全岛缺失株的构建。

缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株的构建及鉴定

目的构建并鉴定HPI毒力岛缺失的EAggEC突变株。方法运用基因重组方法,以irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列,irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列,中间插入有卡那霉素(Km)抗性基因(kan)标记。以pCVD442作为载体,构建含有irp8部分序列和irp5基因的重组自杀质粒pCO85。以EAggECO42为出发菌株,构建缺失irp8￣irp5约24kb的HPI毒力岛功能核心区区域的全岛缺失株EAG85。结果通过接合转移和同源重组,利用蔗糖抗性筛选,pCO85上的同源序列有效的置换了EAggECO42的irp8和irp5基因。PCR方法扩增irp3、ybtA、irp9等基因的结果显示,筛选出的EAG85确为缺失HPI毒力岛基因的EAggEC菌株。结论成功地构建了缺失HPI毒力岛的EAggECO42突变菌株,为进一步阐明HPI毒力岛在EAggEC菌株中的功能建立了重要的物质基础。

犊牛腹泻源大肠杆菌耐药情况及HPI相关基因的检测

本研究旨在明确犊牛腹泻源性大肠杆菌的耐药情况、强毒力岛(HPI)标志基因及相关基因的携带情况,以及大肠杆菌分离株与HPI携带的关系。采集犊牛病理性腹泻样本158份,采用麦康凯培养基和伊红美蓝培养基进行筛选,镜检符合大肠杆菌形态的进行VITEK 2 Compact生化鉴定和PCR鉴定,采用K-B纸片法对大肠杆菌分离株进行药敏试验,应用PCR方法进行分离株HPI相关基因携带情况的检测。结果显示,共分离得到75株大肠杆菌,分离株对阿莫西林、哌拉西林、氨苄西林、头孢唑啉、氟苯尼考、恩诺沙星、四环素的耐药率均>90%,对头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星的耐药率均≥60.00%,对阿米卡星较敏感,耐药率为9.33%;75株大肠杆菌全部耐3种以上药物,多重耐药(≥10)的菌株占85.33%,耐药谱集中在耐14~17种药物,5株对19种药物全部耐药。HPI标志基因irp2的阳性率为100%,其他相关基因fyuA、irp3、irp5、irp8和ytbA的检出率在66.00%以上。综上所述,宁夏地区犊牛腹泻源性大肠杆菌耐药普遍,多重耐药现象严重。

猪源E.coli HPI通过NLRP3/ASC/Caspase-1诱导巨噬细胞焦亡的机制

为探讨猪源E.coli高致病性毒力岛(high pathogenicity island,HPI)对巨噬细胞焦亡的影响,以内毒素(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)建立焦亡阳性对照,使用E.coli WT株(E.coli HPI^(+))和前期构建的E.coli HPI敲除株(E.coliΔHPI)感染巨噬细胞,在感染后不同时间点收集细胞,运用PI染色观察细胞膜损伤情况;RT-qPCR测定NLRP3/ASC/Caspase-1焦亡通路中关键因子的mRNA水平;共聚焦观察NLRP3和Caspase-1的炎性复合体的组装;Western blot技术测定GSDMD和cleaved-GSDMD的表达。结果显示,与E.coliΔHPI组相比,E.coli HPI^(+)焦亡通路关键因子NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD及炎症因子IL-18、IL-1β的mRNA水平均升高;NLRP3和Caspase-1蛋白的表达量升高,共聚焦观察到共定位;E.coli HPI^(+)组的GSDMD及其活性形式cleaved-GSDMD的表达水平高于E.coliΔHPI组。E.coli HPI感染巨噬细胞后,通过上调NLRP3/ASC/Caspase-1通路中关键因子mRNA的水平,诱导NLRP3和Caspase-1炎性复合体的组装,促进cleaved-GSDMD的表达,从而加剧细胞膜损伤,最终诱导巨噬细胞发生焦亡。

奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

【目的】研究奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌HPI携带情况及其与O血清型的关系,并对部分菌株的相关基因序列进行分析。【方法】从中国北京、内蒙古、甘肃、四川、重庆、云南、贵州等7个省市部分地区1 260份临床型和隐性奶牛乳腺炎奶样中分离得到190株大肠杆菌,对分离菌株进行耶尔森菌强毒力岛核心区irp2基因、fyuA基因及HPI毒力岛在大肠杆菌染色体中插入位置的鉴定,分析HPI毒力岛的携带情况及其与分离菌株O血清型之间的关系。【结果】190株大肠杆菌分离株中,irp2基因阳性率为26.31%(50/190),fyuA基因阳性率为18.94%(36/190)。50株HPI+分离株中检出asn_tRNA_intB基因32株,阳性率为64%(32/50)。本试验克隆的irp2基因(273 bp)、fyuA基因(1 071 bp)、asn_tRNA_intB基因(1 512 bp)均与已发表序列高度同源,同源性分别在97.1%、98.2%、97.2%以上,且其HPI毒力岛大多位于大肠杆菌染色体的asn_tRNA位点上。【结论】耶尔森菌HPI在奶牛乳腺炎源大肠杆菌中广泛流行分布,但也存在差异,而不同血清型菌株携带HPI的倾向性可能只与特定的血清型有一定的关系。

禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛(HPI)在禽致病性大肠杆菌(APEC)中的流行情况,根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物,用PCR方法和斑点杂交法对从江苏等地分离的APEC基因组进行了扩增和检测,并对E.coliNTJC040406菌株相关基因进行了克隆和序列分析。结果表明,216株APEC中有44.9%的菌株携带有HPI,序列分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98%以上。提示HPI在APEC中广泛存在,经进一步分析,发现分离菌株是否携带HPI与O78等特定血清型有一定的相关性。

高致病性毒力岛Irp1介导的细菌对Vero细胞黏附作用

高致病性毒力岛(HPI)已经在多种类型大肠杆菌中被发现。为了解HPI-Irp1在细菌致病中的作用,通过生物软件DNAStar的分析,筛选出HPI中irp1和fyuA基因上10个表位作用优势较强的区域。设计特异性引物10对,进行PCR扩增,将获得的PCR产物,插入原核表达载体pET32a,构建重组质粒;将获得的重组质粒转化进入菌毛阴性宿主菌BL21,获得的重组菌用IPTG诱导表达后与Vero细胞混合进行体外作用。结果表明:带有irp1-1基因片段的重组菌BL21-rpET32a-irp1-1表现出对Vero细胞较强的聚集黏附作用,空载体对照和宿主菌对照均未出现相关现象。因而推测irp1-1基因片段编码的产物在细菌对宿主致病过程中,介导了细菌与宿主细胞的相互作用。