鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

PCR技术在食品微生物检测中的应用研究

PCR技术因具有高灵敏度、高特异性和快速性的特点,在食品微生物检测领域广泛使用。本文阐述食品中常见的致病微生物、PCR技术的基本原理、食品中常见致病微生物的PCR检测方法,探讨PCR技术在食品微生物检测中的应用,并介绍PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势。

高危型HPV感染临床检验中实时荧光定量PCR检测法的作用

目的分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染临床检验中实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测法的作用。方法选取80例疑似高危型HPV感染患者,均接受第二代杂交式捕获法(HCⅡ)、实时荧光定量PCR检测,以病理检查结果为金标准,分析实时荧光定量PCR检测价值。结果实时荧光定量PCR检验准确率97.50%、敏感度98.51%、特异度92.31%,均显著高于HCⅡ的78.75%、88.06%、38.46%(P<0.05);实时荧光定量PCR诊断检出率CINⅠ100%、慢性宫颈炎92.31%,均显著高于HCⅡ的88.10%、46.15%(P<0.05)。结论应用实时荧光定量PCR检测法可明显提高高危型HPV感染患者的临床检验准确性,提高治疗方法的针对性。

应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌耐链霉素基因

目的 应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐链霉素基因,为今后该地区突发人间鼠疫的精准临床用药提供理论依据。方法 分离培养海西地区1957—2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的代表性鼠疫菌110株,提取其DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsl基因设计引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探针Probe1 [FAM]和Probe2[VIC],利用荧光定量PCR技术,进行耐药rpsl基因筛查。结果 110株被试菌株中FAM检测均为阳性(RFU峰值>2000);VIC阳性的为0株(RFU峰值<200)。阳性对照和空白对照成立。结论 实时荧光定量PCR结果显示,该地区未检测出耐链霉素菌株。

基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的临床研究

目的 研究基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的价值。方法 选择2022年1月至2022年7月我院进行宫颈癌筛查的患者60例,分别采取多重实时荧光定量PCR技术测定高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA情况,并将病理学检查结果作为金标准,分析基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的价值。结果 HPV 16、18、31、33等九类型的最低检测为10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五类型最低检测是100 copies/μL。另外通过多重实时荧光定量PCR检测高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道内常见病原菌例如大肠埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、金黄色葡萄球菌等,其结果均显示阴性,且检测结果的特异性良好。薄层液基细胞学的检查结果与病理学检查并无差别(P>0.05)。多重实时荧光定量PCR技术的符合率91.67%(55/60),灵敏度83.33%(15/18),特异度95.24%(40/42)。结论 基于多重实时荧光定量PCR技术在HPV E6/E7 mRNA检测中意义重大,存在较高的灵敏度及特异度,可成为宫颈病变筛查的主要方式。

荧光定量PCR技术与酶联免疫法在手足口病肠道病毒检测中的应用价值比较

目的探讨荧光定量PCR技术(FQ-PCR)与酶联免疫法(ELISA)在手足口病肠道病毒检测中的应用价值。方法选取2021年1月至2022年12月就诊于广东省江门市妇幼保健院的疑似238例手足口病患儿,均行FQ-PCR检测与ELISA检测,统计FQ-PCR与ELISA病毒阳性检出率,以病毒分离培养及临床表现、血清实验室综合诊断结果为金标准,对比FQ-PCR与ELISA检测敏感度与特异度、准确度及检测窗口期。结果238例患儿中137例(57.56%)最终确诊为手足口病。FQ-PCR检测敏感度与特异度、准确度均高于ELISA,差异有统计学意义(P<0.05);FQ-PCR病毒阳性检出率较ELISA高,差异有统计学意义(P<0.05);FQ-PCR对通用型肠道病毒、Cox A16、EV71检测窗口期均短于ELISA检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与ELISA相比,FQ-PCR在手足口病肠道病毒检测中具有更高的特异度、敏感度,可提高阳性检出率,且检测窗口期更短,利于临床早期实施治疗。

检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.

Establishment of a Real-time Fluorescent Quantitative PCR Assay for Detection of Genetically Modified Maize Line MON88017

In order to improve the standardized technical systems of quantitative analyses for genetically modified organisms （GMOs） and products, ensure bio-safety and reduce ecological risk in China, a real-time fluorescent quantitative PCR assay was established for detection of genetically modified maize line MON88017. The established method was evaluated based on the specificity, sensitivity, accuracy and measurement uncertainty. The results showed that the established method had strong specificity in detection of genetically modified maize line MON88017. 1.50% MON88017 sample was detected with 29 replica- tions. The average measured value （ 1. 541% ） was close to the actual value （ 1.50% ） and the relative deviation was 2.70%. The variation coefficient of the measured value was 0.110 g ; the recovery was 100.00% and the measurement uncertainty was 0. 096. The limit of detection for genetically modified maize line MON88017 with the established method was 5 copies at the 97.5% confidence level. Thus, the real-time fluorescent quantitative PCR assay established in this study exhibited high specificity, accuracy and sensitivity, which could provide technical support for the safety supervision of genetically modified organ- isms and products in China.

淮安市218批婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌毒力基因检测和耐药性分析

目的 了解淮安市婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌污染现状及其对药物敏感、主要毒力基因携带情况。方法2022~2023年抽取淮安市七个县区的婴幼儿奶粉及婴幼儿辅助食品共218批,根据GB4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》蜡样芽胞杆菌平板计数法(第一法)进行检测,并进行药物敏感性试验,采用荧光定量PCR对检出的蜡样芽胞杆菌进行溶血性(hblC)基因、非溶血性基因(nheB)、呕吐毒素基因(ces)检测。结果 218批婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌检出39批次,检出率达17.89%。在23种药物敏感性试验中,蜡样芽胞杆菌对庆大霉素、阿米卡星、替考拉宁、万古霉素、氯霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星、诺氟沙星敏感率100%,对环丙沙星、米诺环素、四环素、红霉素、克林霉素、莫匹罗星高浓度、复方新诺明、苯唑西林敏感率分别为97.44%、92.31%、89.74%、82.05%、38.46%、23.08%、20.51%、5.13%,对达托霉素非敏感,对头孢洛林、氨苄西林、青霉素全部耐药。溶血性hblC基因携带率高达100%,非溶血性基因nheB携带率为58.97%,本次试验未检出呕吐毒素基因ces。结论 婴幼儿食品蜡样芽孢杆菌检出率较高且检出菌中携带至少一种毒力基因的概率高达100%。对头孢洛林、氨苄西林、青霉素全部耐药,对达托霉素、苯唑西林等药物敏感性差,可为临床用药方案提供指导。

实时荧光PCR技术在高危型人乳头瘤病毒检测中的价值

目的 分析实时荧光PCR技术在高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测中的价值。方法 选取本院行病理诊断检查的66例高危型HPV感染者及68例健康女性为研究对象,均实施实时荧光PCR技术和第二代杂交捕获试验(HC-Ⅱ)技术行HPV检测,比较两种检测技术的诊断效能。结果 以病理检验结果为金标准,实时荧光PCR技术的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率分别为94.03%、96.97%、91.18%、91.43%、96.88%、94.03%,高于HC-Ⅱ技术的76.12%、81.82%、70.59%、72.97%、80.00%、76.12%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 高危型HPV检测中应用实时荧光PCR技术,能够保证疾病检测结果的准确性和可靠性,进而为后续的临床治疗提供支持,应用价值较高。

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段,将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,验证所得到的重组质粒,以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260,并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品;进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99),实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线,鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100CFU/m L。结论本方法便捷、高效、可靠,可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。

兔出血症病毒2型TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

以新发生的兔出血症病毒2型(RHDV2)SC 2020/04株VP60基因序列为参考,设计出1对特异性引物和TaqMan探针,建立了一种快速、灵敏且特异的用于检测新型病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示:本研究建立的方法,标准曲线线性关系良好,R^(2)值达到0.999;其特异性较好,与兔出血症病毒1型(RHDV1)、仙台病毒(SV)和轮状病毒(RRV)病原均无交叉反应;灵敏性高,最低检出量为1μl 1×10拷贝;且重复性良好,批内和批间试验的变异系数平均值均小于2%。临床检测结果表明,利用该方法对108份临床病料进行检测,检出RHDV2阳性样品72份,检出率为66.7%,明显高于常规的RT-PCR方法(62.0%)。结果证明,新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法适合于RHDV2感染的特异性诊断。

实时荧光定量PCR方法检测转基因玉米MIR604

转基因玉米MIR604是瑞士先正达公司2005年研发的抗虫玉米,中国于2008年批准MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。为了精确定量检测MIR604及其加工产品,在MIR604的左侧边界序列和玉米基因组之间设计引物和探针,成功建立了MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法。采用该方法设计的引物和探针,对6种非转基因作物、MIR604及其他非目标转基因作物进行检测,除MIR604外,其余样品均未检测到MIR604分子片段的扩增信号;对已知含量为1%的MIR604标准品进行定量检测,测量值为1.07%,接近真实值1%;灵敏度实验结果显示,该方法能检测到仅5个拷贝的MIR604分子片段。该试验所建立的MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性、准确度及灵敏度,可用于转基因玉米MIR604的定量检测。

实时荧光定量PCR在植物病害中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,越来越受到人们的重视。它以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,近年来,实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上不断深入,大大提高了植物病害的检测效率和监测防治水平。结合了最近几年来应用于检测和鉴定植物病原病害的实时荧光定量PCR过程中引物与探针的设计、反应过程、结果评价情况,综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒、线虫引发的植物病害的检测与应用。

高敏与普通荧光定量PCR技术在慢乙肝患者抗病毒疗效监测中的对比研究

目的比较高灵敏度与普通荧光定量PCR技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒疗效监测中的区别。方法对49例CHB患者141份采用普通PCR检测结果为阴性(<500 IU/mL)标本,采用高敏PCR试剂进行复查。结果根据高敏PCR血清HBV DNA定量检测结果,141份采用普通PCR检测结果阴性标本存在以下5种状况,即>500、20~500、10~20、<10 IU/mL和阴性,比例分别为13.5%、31.9%、18.4%、30.5%和5.7%。随着血清HBV DNA水平的逐渐增高,各组ALT、AST水平和异常升高率也存在逐渐增加的趋势,但是仅仅各组AST水平差异有显著意义(P<0.05)。随着血清HBV DNA水平逐渐降低,各组血清HBeAg阳性率和水平也存在逐渐降低的趋势。其中,HBV DNA阴性组血清HBeAg阳性率显著低于10~20 IU/mL组和>500 IU/mL组(P<0.05)。结论与普通PCR技术相比,高灵敏度的HBV DNA荧光定量PCR技术在CHB患者抗病毒治疗监测中准确性更高。

虚拟仿真在“生物技术药物学实验”中的应用

由于许多实验环境无法满足新冠病毒取样和检测的要求,且病原微生物新冠病毒具有强传染性和致病性,学生很难开展感染性实验操作。因此,将虚拟仿真技术与新冠病毒实时荧光定量PCR检测相结合构建了虚拟实验平台,其中涵盖实验导学、临床取样及实时荧光定量PCR检测等主要内容,重点模拟RNA提取、病毒序列获取与分析、引物设计、反转录、实时荧光定量PCR及结果分析等操作。通过虚拟环境,在保障学生安全的基础上,让学生更深入地了解新冠病毒实时荧光定量PCR的检测,大大提高了生物技术药物学实验教学的效率。

实时荧光PCR在乙肝病毒DNA检测中的临床意义

目的用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者HBV DNA结果进行分析,以探讨其临床诊疗意义。方法对630例血清标本用时间分辨荧光免疫技术定量测定乙肝炎病毒血清学指标,用荧光定量PCR法检测血标本中的HBVDNA,并依据乙肝两对半结果进行归类分组。结果 630份标本中,大三阳206例标本中有173份HBV-DNA为阳性,阳性率为84.0%,其PCR定量拷贝数为(2.13±0.72)×107/ml;小三阳211例中有64份HBV-DNA阳性,阳性率达到30.3%,PCR定量拷贝数为(1.61±0.85)×106/ml;69份HBs Ab(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+)标本有33份HBV-DNA阳性,阳性率47.8%;27份HBs Ag(+)、HBc Ab(+)标本中有8份HBV-DNA为阳性,阳性率为29.6%;22份HBe Ab(+)、HBc Ab(+)标本有3份PCR HBV-DNA阳性,阳性率13.6%;20份HBs Ag(+)、HBs Ab(+)、HBe Ag(+)、HBc Ab(+)标本中有17份HBV-DNA为阳性,阳性率为85.0%;17份HBs Ab(+)、HBe Ab(+)阳性标本有3份PCR HBV-DNA阳性,阳性率为17.6%;13份HBs Ab(+)、HBc Ab(+)标本有1份HBV-DNA阳性,阳性率7.7%;12份HBc Ab(+)标本有5份PCR HBV-DNA阳性,阳性率为41.7%;2份HBs Ab(+)的标本HBV-DNA均为阴性,PCR定量拷贝数为<1.00E×103;1份HBs Ag(+)标本HBV-DNA均为阳性,阳性率为100%;其余30例全阴性结果和各少见模式基本未见有HBV-DNA的检出。结论 PCR定量测定HBV-DNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效观察。

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON88017

为完善中国转基因生物及产品定量分析标准化技术体系,保障中国生物安全和降低生态风险,本研究建立了转基因玉米MON88017及产品的实时荧光定量PCR分析方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价了该方法。结果显示该方法分析转基因玉米MON88017特异性很强;29次重复测量含量为1.50%的转基因玉米MON88017样品,平均测量值(1.541%)接近真实值(1.50%),相对偏差为2.70%,测量值的变异系数为0.110 4,回收率为100.00%,测量不确定度为0.096;在97.5%的置信水平下能检测到最低含量为5个拷贝的MON88017分子片段。因此,本研究建立的转基因玉米MON88017实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度和灵敏度,能为中国转基因生物安全监管提供良好的技术支撑。

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异(t=1.006,P>0.05);免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999(P<0.001);灵敏度为4×102IU/ml,CV<6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。