小麦基因组文库的构建及高分子量(HMW)谷蛋白亚基基因的筛选

以小麦 NE7060的黄化苗为材料提取总 DNA,用 Sau3A 制备14～22kb 的酶切片段,以λEMBL3为载体构建了5.5×10~6个重组子的基因文库。根据已知的小麦 HMW 谷蛋白亚基基因5′端、中部重复区和3′端序列合成了三个寡核苷酸为探针,经原位杂交和斑点杂交筛选到10个阳性克隆,并对其中两个阳性克隆用 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和 Sal Ⅰ进行酶切,初步确定了插入片段长度约20.0kb,建立了插入片段的物理图谱。

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘膦的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EP-SPs、1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体进行Southern分析,发现其中有1株再生植株基因组中整合了3个外源基因,有2株的基因组中同时整合了EPSPs和1Dx5基因,1株的基因组中整合了EPSPs和1Dy10基因。此外,在转化过程中发现,幼穗是比幼胚更为合适的转化受体,并且转化受体具有合适的转化时期。

小麦高分子量谷蛋白亚基及其基因的研究进展

主要介绍了小麦高分子量谷蛋白亚基 (HMW- GS)及其基因的研究进展情况。目前 ,转基因小麦的技术已经逐渐成熟。由于分子生物学领域分子标记技术的迅速发展 ,尤其是PCR技术的广泛应用 ,为实现外源优良储藏蛋白基因导入改良品种提供了可能。利用已知小麦品种的基因序列设计引物 ,从众多的未知小麦品种中扩增出新基因加以研究并做外源优质HMW-

无载体框架序列转基因小麦中外源基因表达框的遗传分析

通过基因枪介导转化无载体框架序列的基因最小框架是一种新的基因转化技术。在应用此新转化系统获得转1Ax1小麦植株的基础上,着重研究了转基因植株中外源1Ax1基因表达框的遗传。结果表明:无载体框架结构的1Ax1基因在T1代中呈现3∶1的分离,符合单基因位点孟德尔遗传模式。首次在小麦中揭示了无载体框架序列基因遗传转化技术的可行性,并且证实了外源基因最小表达框在转基因后代中的稳定遗传。

构建及表达小麦高分子量容蛋白基因5′端调控序列缺失突变体嵌合质粒

通过定点突变，在小麦高分子量（ＨＭＷ）谷蛋白基因５′上游调控序列的ＴＡＴＡｂｏｘ与基因翻译起始密码子ＡＴＧ之间，改变三个碱基，产生新的ＢａｍＨⅠ内切酶位点．在调控序列中，选择四个合适的内切酶，对上游序列进行缺失，分离到四个大小分别为２４００、６１０、４４０和１１０ｂｐ的含有不同调控元件的ＨＭＷ谷蛋白基因启动子，与质粒ｐＢＩ１０１．１的报告基因ＧＵＳ重组，构建了四个嵌合质粒ｐＷＧ２４００、ｐＷＧ６００、ｐＷＧ４４０和ｐＷＧ１００．经基因枪、微束激光和ＰＥＧ等方法将ｐＷＧ２４００转化玉米胚乳悬浮细胞，ＧＵＳ基因获得表达．这为进一步研究ＨＭＷ谷蛋白基因的调控机理奠定了基础．

江苏淮北部分小麦品种品质性状相关重要基因的检测

为了解江苏淮北小麦品种重要品质性状相关基因状况,以20份近期审定的徐麦系列和淮麦系列小麦品种以及12份小麦对照材料为试验材料,采用SDS-PAGE电泳与PCR检测相结合,检测了小麦高分子量麦谷蛋白亚基;同时采用共显性PCR标记筛查1BL/1RS易位系以及Wx基因突变型。结果显示,江苏淮北小麦品种Glu-A1位点含3种亚基,其中1亚基占75%;Glu-B1位点有4种亚基,7+8亚基占60%;Glu-D1位点有3种亚基,5+10亚基占50%;1BL/1RS易位系有14份,占全部品种的70%;所有品种均为Wx基因野生型。

类大麦材料y型高分子量谷蛋白基因不表达的鉴定

利用SDS-PAGE检测了2份类大麦属植物的高分子量谷蛋白亚基组成,在小麦的高分子量区域仅检测到1条蛋白带,因此怀疑其y型亚基没有表达。根据其它高分子量谷蛋白提取方法的结果以及基因编码区部分序列测定,确认其y型高分子量谷蛋白基因是沉默的。

长发带芒草y型高分子量谷蛋白亚基的鉴定与分析

为了证实长发带芒草中的y型高分子量谷蛋白亚基的存在,利用SDS-PAGE分析了3份长发带芒草的高分子量谷蛋白亚基组成,发现其y亚基的迁移率均较普通小麦中迁移率最快的D y12亚基迁移率更快,应用PCR扩增、序列测定及基因编码区体外表达等方法研究了1份材料中的y亚基,确认了长发带芒草比普通小麦中迁移率最快的D y12亚基迁移率更快的T ay亚基的真实存在及表达。研究结果证实带芒草属具有与普通小麦中相类似的y型高分子量谷蛋白亚基。

节节麦高分子量谷蛋白Dx5~t+Dy12~t亚基组合中Dy12~t亚基的序列测定与分析

为了认识节节麦5t+12t亚基品质表现突出的分子基础,利用SDS-PAGE分析研究了该亚基组合中12t亚基的电泳迁移率并克隆和测序了该亚基基因。结果表明,该12t亚基在SDS-PAGE上的电泳迁移率与普通小麦中的Dy12具有一致的电泳迁移率,但与Dy10的电泳迁移率差异明显。而氨基酸序列比较结果显示,12t亚基的分子序列与Dy10的相似程度非常高,二者仅存在4个氨基酸的替换,而它与Dy12的分子序列存在较大的差异,不但包括12个氨基酸的替换,同时包括2个六肽氨基酸和另外4个氨基酸部位的插入和缺失变化。本研究结果表明,节节麦高分子量谷蛋白Dx5t+Dy12t亚基赋予小麦优良加工品质的主要原因可能与12t亚基与小麦Dy10非常相似,导致这一亚基组合更倾向与Dx5+Dy10有一定关系。

小麦麦谷蛋白亚基及其基因的研究进展

作为人类蛋白质的主要来源之一,小麦种子贮藏蛋白质的组成、结构及其功能一直为研究者所关注.随着研究的深入,对于麦谷蛋白基因的染色体定位、结构特点也逐渐为人们所了解.这对于改善小麦籽粒的品质具有非常重要的意义.对近年来小麦麦谷蛋白亚基(高分子量麦谷蛋白亚基HMW-GS和低分子量麦谷蛋白亚基LMW-GS)的提取分离、凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等分离技术及其编码基因的染色体定位、多态性变化等方面的研究进展作一简要概述.

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS_PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsisdelileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2 0 5 2bp ,编码长度为6 6 1个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D ,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C .delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。

长穗偃麦草中E和E_1基因组高分子量麦谷蛋白基因启动子部分序列的进化分析

通过PCR克隆的方法,获得了分别来自二倍体长穗偃麦草的E基因组和四倍体长穗偃麦草的E_1基因组的4个高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因启动子的部分序列。序列分析表明,它们之间的同源性较高,两个x型亚基启动子序列之间只有1个碱基的差异,而两个y型亚基启动子序列完全相同,x和y型亚基启动子序列之间的长度和部分碱基位点都有差异。推测四倍体长穗偃麦草中的E_1基因组可能起源于二倍体的E基因组。与来自小麦族的A、B、D和G基因组部分亚基基因的启动子序列比较表明,小麦族的这一区域在进化上是相当保守的,不同基因组来源的序列同源性都在90％以上。经过对这些序列的聚类分析,表明长穗偃麦草的y型HMW-GS基因与其他亚基基因的进化关系较远,而x型亚基基因与一个来自小麦1B染色体的亚基基因关系最近。

聚合酶链反应(PCR)所得小麦高分子量谷蛋白亚基基因片段的克隆和顺序分析

应用聚合酶链反应(PCR)法,以两种人工合成的寡核苷酸片段为引物对,在Taq DNA聚合酶催化下,经35个反应循环后,从'扬麦4号'的核DNA中直接扩增出小麦(Triticumaestivum L.)高分子量(HMW)谷蛋白亚基的基因片段。体外扩增得到的片段克隆于pBSSK^+质粒中,并对608bp插入片段的顺序进行了双向测定。结果表明该克隆片段包含了小麦HMW谷蛋白亚基基因启动子CAAT box下游区域以及为谷蛋白肽链N-末端166个氨基酸编码的区域,通过与其它小麦中已知HMW谷蛋白亚基基因结构进行比较,表明本文扩增得到的顺序代表一个新的HMW谷蛋白亚基基因。

新型HMW-GS基因H1By16改良转基因小麦面粉品质

小麦高分子量麦谷蛋白亚基的组成和含量是决定面团弹性的主要因素,发掘和利用新的高分子量麦谷蛋白亚基是提高小麦面粉品质的关键。我们利用农杆菌转化技术将小麦体细胞杂种来源的高分子量麦谷蛋白亚基等位变异新基因H1By16转入高产、抗盐小麦新品种‘山融3号’(SR3),经过PCR筛选和遗传分析,我们获得了3个转基因纯系T16-like-1、-2和-3。通过SDS-PAGE技术分析了转基因株系的高分子量麦谷蛋白亚基表达情况,在T16-like-2和-3两个株系中,目的基因出现表达沉默现象;而在株系T16-like-1中,目的基因表达,并且降低了内源高分子量麦谷蛋白亚基基因1By9的表达量。微面团揉面实验显示新型高分子量谷麦蛋白亚基H1By16可以提高小麦的面粉品质。

与小麦高分子量谷蛋白基因探针杂交的阳性克隆分离及基因在重组子上的定位

将经San 3A部分酶切后的小麦总DNA片段克隆到λCharon40载体上构建了小麦基因文库.以两个人工合成的同源于小麦高分子量(HMW)谷蛋白基因的片段对此基因库进行筛选,获得了两个阳性克隆,推测其中一个包含了HMW谷蛋白全部的基因顺序.两个克隆的部分限制性内切酶位点已被确定.在Southern杂交中,用位于基因编码区内的寡核苷酸片段作探针,将阳性部分定位在一定的酶切片段上.

小麦A,B,D基因组可能供体种的高分子量麦谷蛋白亚基基因进化式样的分析

通过PCR和克隆的方法得到了普通小麦(TriticumaestivumL.)B基因组所有可能供体以及小麦近缘种黑麦的HMW GS基因5′端序列,对所得序列结合已发表的序列进行系统发育分析,结果表明二倍体中该基因2个拷贝的结构不对称.