hilA基因两端51bp序列对示踪标记性绿色荧光蛋白在禽肠炎沙门氏菌中倍增表达效率的鉴定

为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标记的重组禽肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)并鉴定其遗传稳定性,本研究通过重叠延伸PCR构建5'端含有T7启动子和核糖体结合位点(RBS),3'端含有T7终止子序列的增强型GFP(e GFP)表达盒,并将e GFP表达盒插入p MD18-T载体中构建p MD-e GFP原核表达重组质粒,将其转化于S.enteritidis。结果显示e GFP能够在S.enteritidis中持续表达。进一步将S.enteritidis hil A基因两端的51 bp序列分别添加到p MD-e GFP中e GFP表达盒的两端,构建p MD-He GFP重组质粒。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析与p MD-e GFP相比,p MD-He GFP转化S.enteritidis后,其e GFP的荧光强度提高约30倍。通过在无抗生素选择压力下连续传20代次,重组S.enteritidis中e GFP仍然能够稳定表达。本研究结果为进一步研究S.enteritidis在动物体内的分布和定植规律等提供了一种具有荧光示踪标记的目标菌,并为其他细菌的同类研究提供了借鉴。

喹诺酮对沙门菌毒力基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响

目的:研究喹诺酮对沙门菌毒力岛基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响。方法:用多阶段诱导方式体外筛选耐喹诺酮沙门菌株,用荧光定量PCR方法测定喹诺酮敏感株和耐药株的hilA和invA基因的mRNA表达水平。结果:与喹诺酮敏感株相比,喹诺酮耐药株的hilA和invA的mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)。结论:喹诺酮可导致沙门菌毒力相关基因表达水平降低,这意味着喹诺酮耐药株毒力和致病性的降低。

肠炎沙门氏菌ssrAB、hilA、hilD基因缺失菌株的构建及其生物学特性

【背景】沙门氏菌(Salmonella)是重要的人畜共患病原菌,由于耐药菌株的不断出现,新型防治方法的研究迫在眉睫。【目的】探究ssrAB、hilA、hilD基因对肠炎沙门氏菌致病作用的影响,筛选安全可靠的沙门氏菌减毒活疫苗或载体用菌株。【方法】采用自杀性质粒介导的同源重组技术,分别构建ssrAB、hilA、hilD单基因缺失株(ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD)、双基因缺失株(ΔssrABhilA、ΔssrABhilD、ΔhilAhilD)和三基因缺失株(ΔssrABhilAhilD),并比较上述缺失菌株与亲本菌株间生物学特性的差异。【结果】基因缺失后菌株的生长速率无显著变化(P>0.05);除ΔhilD生物膜形成能力最强外,其他基因缺失菌株生物膜形成能力变化不显著(P>0.05);ΔssrABhilAhilD和ΔssrABhilA的LD50值最高,ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD次之;亲本菌株引起的小鼠十二指肠的病变程度较所有缺失菌株明显严重;在所有缺失菌株中,ΔssrABhilAhilD对HeLa细胞的黏附力最低,ΔhilD在小鼠体内的定殖率最高;而机体分泌IL-1、IL-18、IFN-γ的能力与沙门氏菌ssrAB、hilA、hilD基因无显著相关性(P>0.05)。【结论】构建的7株基因缺失株中,ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD、ΔssrABhilA和ΔssrABhilAhilD有致病力低、生长速率良好、能有效刺激细胞因子产生等特性,具备作为沙门氏菌减毒活疫苗或载体的潜质。

肠炎沙门菌调控基因hilD与hilA的体外表达规律研究

利用原核表达载体pCold I构建肠炎沙门菌转录调控蛋白HilD和HilA的重组表达菌,并采用Western-blot技术检测两者在体外培养条件下的表达规律。结果表明:成功构建了重组表达大肠埃希菌(E.coli)BL21(pCold I-hilD)和E.coli BL21(pCold I-hilA),经IPTG诱导得到了重组表达的rHis-HilD和rHis-HilA蛋白。将重组表达的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备蛋白的多克隆抗体,Western-blot进一步证明了抗体与蛋白可发生特异性反应。肠炎沙门菌C50041在LB培养条件下,HilD与HilA蛋白表现出不同的表达规律,从而为体外研究肠炎沙门菌SPI1与SPI2效应蛋白的表达和功能研究奠定了基础。

PCR法与细菌培养法在急性腹泻患者沙门氏菌检测中的应用比较

目的通过与传统细菌培养法比较,明确聚合酶链反应(PCR)法能否提高沙门氏菌检出率。方法分别应用传统细菌培养法(含生化、血清学鉴定)及普通PCR方法,对300例急性腹泻患者粪标本进行检测,将两种方法检测的阳性率进行比较。结果300例急性腹泻患者粪标本,传统法分离培养出沙门氏菌29例,阳性率9.67%;普通PCR检测沙门氏菌高侵袭性位点A(hyperinvasive locus A,hilA)阳性65例,阳性率为21.67%,两者差异有统计学意义(P<0.01)。其中传统法分离培养阳性的标本,PCR检测均为阳性。PCR法扩增阳性的65例粪标本hilA基因测序结果与基因库标准菌株序列一致率为100%。结论与传统细菌培养生化法相比,PCR法可提高腹泻患者沙门氏菌的检出率,缩短检出时间,适于临床快速诊断。

HeLa细胞端粒酶的分离纯化及其蛋白质组分的研究

根据端粒酶含有蛋白质组分和RNA组分的特点 ,采用寡核苷酸亲和纯化法从HeLa细胞蛋白粗提物中分离纯化人类端粒酶 ,纯化产物以TRAP法检测其延伸端粒活性 ,并采用RNA印迹法进行鉴定 ,然后从纯化产物中分离蛋白质组分 ,以SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其蛋白质亚基成分 ,可见到 4种蛋白质亚基成分 ,与蛋白质分子质量标准比较 ,有两条位置接近 2 12 2ku ,一条接近 116 0ku ,一条接近 42 7ku .结果表明 ,蛋白质寡核苷酸亲和纯化法一步性分离纯化HeLa细胞端粒酶可得到端粒酶活性片段 .

肺门区横断面CT与解剖对照研究

目的 :了解正常肺门断层解剖及CT表现。方法 :结合 2 0例胸部连续横断层标本 ,研究 5 6例肺门区的CT表现。结果 :右侧 :右上肺静脉尖支位于尖段支气管和动脉与上腔静脉之间 ,肺门外侧为右上肺静脉后支 ,后方为后段支气管和同名动脉分支。左侧 :左肺静脉尖后支位于尖后段支气管和动脉的前方 ,或组成肺门外侧。以上观察与CT表现一致。 85 .7% (48例 )左肺静脉尖后支位于尖后段支气管和动脉的前方 ;14 .3 % (8例 )位于肺门外侧。 85 % (17例 )右上肺静脉后支则位于前、后段支气管二者的夹角内 ,15 %(3例 )在此层面远离肺门 ;CT上 ,92 .9% (5 2例 )右上肺静脉后支则位于前、后段支气管的夹角内 ,7.1% (4例 )在此层面远离肺门。结论 :右肺门上、中区的形态与上肺静脉尖支和后支的位置和汇入上肺静脉方式有关。左肺门上区的形态与肺动脉和上肺静脉之间的关系有关 ;左肺门中区的形态则取决于左肺动脉舌支的发支情况。双肺门下区的形态取决于下叶肺动脉的分支形式。

792例恶性胆道梗阻内支架引流随访研究

目的评价支架置入治疗恶性胆道梗阻的临床效果及价值。方法792例恶性胆管梗阻中,高位胆管梗阻398例。中低位胆管梗阻394例,采用单点位单支架及双点位双通道双支架置入,单点位单通道双支架置入或单支架置入配合外引流的治疗方法。测定术前、术后血清总胆红素水平并进行t检验,差异显著(P<0.05),且均以直接胆红素下降为主。生存满6个月578例,73%(578/792);生存6个月以上505例,64%(505/792);生存一年或一年以上329例,45%(329/792)。结论①单点位单支架及双点位双通道双支架,单点位单通道双支架置入或单支架配合外引流,均能实现梗阻胆管全面充分内引流。②支架置入联合抗肿瘤治疗可提高病人生存率和降低支架再梗阻的发生。

肝门部高位恶性胆管梗阻支架引流的临床意义探讨

目的探讨肝门部高位恶性胆管梗阻支架引流的临床意义。方法随访研究792例恶性胆道梗阻内支架引流通过内支架置入术,重建管腔并恢复和维持其生理功能。结果全组病例血清总胆红素术前术后水平比较差异显著(P<0.05),且均以直接胆红素下降为主,胆管癌患者中位生存时间优于其他恶性肿瘤。结论 PTBD技术对肝门部恶性胆管梗阻有重要临床意义。

Ⅳ期肝癌的诊断和治疗

根据52例肝癌超越半肝、侵犯韧带、膈肌、腹膜、邻近脏器,侵入门静脉、肝静脉、胆管,转移至淋巴结和远处器官的11种表现订出诊断Ⅳ期肝癌的细则,丰富了肝癌TNM分期的内容。介绍了癌灶内A-P瘘,门静脉、肝静脉或胆管癌栓的临床表现和诊断方法。根据诊断细则采用不同疗法。肝门区域血管阻断切除载瘤肝段33例,加门静脉或肝动脉插管19例,摘除门静脉癌栓4例。生存18例中存活1年以上10例,最长2年7月。MTC、TAE、TAC等亦能延长寿命。肝功损害及肝静脉、下腔静脉癌栓的疗法有待探讨。

纤维支气管镜对肺结节病的诊断价值

目的研究纤维支气管镜对肺结节病的诊断价值,提高临床诊断符合率。方法对22例肺结节病的临床资料进行回顾性调查分析。结果有病理学依据的22例肺结节病。男7例,女15例;年龄14￣66岁,症状除了呼吸道症状外,还有多系统损害表现,胸部X线片及CT提示双侧肺门肿大21例,单侧肺门肿大1例,纵隔淋巴结肿大16例,经皮肤黏膜淋巴结活检确诊8例,纤维支气管镜活检确诊14例。其中纤维支气管镜阳性率为77.8(14/18),结节病分类Ⅰ期16例,Ⅱ期6例。结论提示纤维支气管镜检查有助于肺结节病病理诊断并治疗。

紧贴肝门大血管的肝癌手术并发症的防治

目的 探讨已累及肝内主干血管的肝癌手术经验 ,防止并发症与提高术后疗效。方法 将近 10年来手术切除的肝门区肿瘤病人中 ,选择了紧贴肝内大血管 1cm以内的肝癌 78例 ,肿瘤直径≤ 5cm 2 1例 ,>5cm 5 7例 ,最大者为 2 0cm× 2 0cm× 18cm ,对术中如何防治并发症发生等进行总结分析。结果 术中并发大出血、术后胆瘘、伤及健侧肝门发生率分别为 8 9% ,3 8%和 1 2 % ,无手术死亡。结论 虽然此类手术难度大、风险大 ,只要重视手术适应证选择、手术方法改进 ,仍可提高手术安全性 ,防止并发症的发生。

肉桂油口服液抗沙门菌Ⅲ型分泌系统的作用机制

为分析肉桂油口服液对沙门菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制,以鸡白痢沙门菌CVCC1798和鼠伤寒沙门菌SL1344为研究对象,基于主要毒力因子SipA的分泌表型,利用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR分析检测肉桂油口服液对沙门菌主要毒力因子SipA和SipB分泌的影响及机制。结果显示,肉桂油口服液在不影响细菌生长的浓度范围内,可抑制沙门菌Ⅲ型分泌系统活性及其入侵细胞的能力。蛋白免疫印迹表明肉桂油口服液降低沙门菌Ⅲ型分泌系统主要效应蛋白SipA和SipB的分泌及调控蛋白HilA的表达。荧光定量PCR分析发现肉桂油口服液抑制沙门菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白及调控蛋白的转录水平。结果提示肉桂油口服液可有效抑制Ⅲ型分泌系统效应蛋白及调控蛋白的转录和分泌,表明肉桂油口服液是一种潜在抗沙门菌感染先导复合物。

假定调控蛋白STM14_3514可降低鼠伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力

【目的】研究鼠伤寒沙门菌致病岛1(SPI-1)内部的假定调控蛋白STM14_3514的功能及其作用机制。【方法】以鼠伤寒沙门菌模式菌株ATCC 14028为亲本株,构建了STM14_3514基因的缺失突变体及互补菌株,通过小鼠实验、细胞侵袭实验、Western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等实验技术,深入研究了STM14_3514基因对鼠伤寒沙门菌致病过程的影响。【结果】STM14_3514突变提高了细菌对小鼠的致病能力,突变体在小鼠肠道、肝和脾中的定殖能力均增强;细胞实验揭示,突变体致病力提升主要由于STM14_3514突变能显著增强细菌对上皮细胞的侵袭力(>2倍,P<0.05)。q RT-PCR及Western blot分析表明,STM14_3514显著抑制SPI-1内部主要调控因子hil A及侵袭相关基因的表达。此外,STM14_3514对hil A的抑制由Hil C介导。【结论】STM14_3514是鼠伤寒沙门菌SPI-1内部的负调控因子,能通过Hil C抑制hil A及SPI-1其他入侵基因的表达,该基因的生物学意义可能与细菌进入细胞后对SPI-1的负调控相关。