藏药八味沉香散对低氧大鼠学习记忆的影响研究

目的研究在低氧下藏药八味沉香散对大鼠学习、记忆能力的影响。方法应用MORRIS水迷宫的学习记忆动物模型来观测藏药八味沉香散对低氧下大鼠空间学习、记忆能力的影响,并通过电镜图像分析和细胞形态计量研究藏药八味沉香散对神经突触可塑性的影响。结果各低氧组大鼠均出现空间学习记忆障碍,表现为MORRIS水迷宫测试潜伏期延长(P<0.05),各低氧组第1天潜伏期均明显延长,而低氧Rg1药物组和低氧BCP药物组与低氧对照组相比潜伏期逐渐缩短(P<0.05),但潜伏期都长于常氧下各组。电镜下观察到各低氧组的海马CA3区PSD厚度变薄、突触间隙增宽、突触活性区长度缩短,与各常氧组相比差异有显著性(P<0.05),低氧Rg1药物组和低氧BCP药物组与低氧对照组相比PSD厚度较厚、突触间隙较窄。结论在低氧下海马CA3区突触形态结构的变化是导致学习记忆功能减退的形态学基础,八味沉香散对低氧下大鼠海马CA3区突触形态结构的维持有一定的保护作用,对大鼠空间学习记忆有一定的促进作用。

放射性脑损伤大鼠海马神经元P35及P25的表达

目的建立放射性脑损伤大鼠模型并观察P35、P25蛋白的表达情况。方法120只雄性SD大鼠随机分为单次全脑照射0、10、20、30 Gy 4个组。构建大鼠的放射性损伤模型,尼氏染色观察各组大鼠海马CAl区神经元的数目。组织匀浆法提取海马蛋白,Western blot法检测海马区P35、P25蛋白的表达。结果与0 Gy组比较,10 Gy组神经细胞死亡、P35及P25表达差异不明显(P>0.05);20、30 Gy组存活神经元减少,P35表达减少,P25表达增加(P<0.05)。结论放射性损伤可导致海马区神经元损伤,可能与P35和P25蛋白表达变化有关。

癫痫发作后成鼠及幼鼠海马神经发生的改变

目的:观察幼鼠及成鼠癫痫发作后海马神经发生的变化。方法:选用3周龄和成年雄性SD大鼠,氯化锂-匹罗卡品药物点燃造模,造模成功后根据溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)注射时间点分为24 h组、2周组,并设相应的对照组。通过免疫荧光染色技术在激光共聚焦显微镜下观察幼鼠及成年鼠海马齿状回颗粒细胞层神经细胞的增殖情况。结果:(1)幼鼠24 h及2周实验组海马齿状回颗粒细胞层BrdU阳性细胞数均显著高于相应对照组(P<0.05),且24 h组较2周组显著增多(P<0.05);(2)成年鼠24 h实验组的BrdU阳性细胞数明显多于相应对照组(P<0.05),而2周组则相反(P<0.05)。结论:癫痫发作可导致海马神经发生的改变,幼鼠癫痫发作后海马齿状回颗粒细胞层神经细胞增殖显著升高,但随着时间延长呈下降趋势。慢性癫痫发作可引起成年鼠海马神经细胞增殖的降低。

脑神康胶囊对培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用

目的观察益气补肾中药脑神康胶囊对体外培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用。方法原代培养大鼠海马神经元,随机分为对照组,损伤组,脑神康胶囊高、中、低浓度组。对照组正常培养,损伤组及脑神康胶囊各浓度组建立缺氧复氧损伤模型,其中脑神康胶囊各浓度组于复氧时换以不同浓度(5%、10%、20%)含药血清的培养液,检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活力及丙二醛(MDA)含量,测定细胞存活率及凋亡率,RT-PCR法检测bcl-2 mRNA和bax mRNA的表达及两者比值。结果与对照组比较,损伤组SOD活性及细胞存活率均明显下降(P<0.01),MDA含量、LDH活力及细胞凋亡率均显著升高(P<0.01),bcl-2 mRNA表达下降,bax mRNA表达升高,bcl-2/bax降低(均P<0.01);脑神康胶囊各浓度组均较损伤组SOD活性及细胞存活率均升高(P<0.01),MDA含量及细胞凋亡率均降低(P<0.01),LDH活力及bax mRNA表达降低(P<0.01,P<0.05),bcl-2 mRNA表达升高,bcl-2/bax增加(均P<0.01),且呈明显的剂量依赖性。结论脑神康胶囊对海马神经元缺氧复氧损伤有明显的保护作用,其作用机制可能与其提高神经元抗氧化能力、调节凋亡相关蛋白、减少凋亡密切相关。

卵巢移植对去势大鼠海马神经元数量和ER-β、NG表达的影响

目的:观察去势大鼠卵巢移植后海马神经元数量变化及雌激素受体β(ER-β)和神经颗粒素(NG)表达的变化,评价卵巢移植对中枢神经的保护作用。方法:成年雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)后,在肾被膜下移植出生3日内乳鼠的卵巢,于干预后的4、7、14、21 d和28 d,通过Nissl染色计数海马神经元的数量,采用免疫组化法观察海马神经元ER-β和NG蛋白的表达情况,并与OVX组和正常对照组比较。结果:与OVX组相比,卵巢移植组随移植时间的延长,海马神经元的数量逐步恢复;ER-β和NG蛋白的表达在海马各区均有所升高(P<0.05)。结论:卵巢移植可以防止海马神经元数量的减少,并促进ER-β和NG表达,发挥雌激素对中枢神经系统的保护作用。

缺氧缺糖海马神经元模型最佳造模时间的选择

目的:建立可靠合理的海马神经元缺氧缺糖(OGD)模型。方法:用培养5 d的海马神经元细胞,采用三气培养箱联合EBSS液,进行OGD造模;于培养0.5、1、2及3 h时收集海马神经元细胞,倒置显微镜下观察海马细胞的形态,并采用MTT法通过检测海马细胞的吸光度(OD)值绘制海马神经元OGD损伤时效曲线,筛选海马神经元OGD最佳造模时间。结果:倒置显微镜下可见随着OGD时间的延长,神经元细胞受损越严重,生长状态越差,胞体从正常的饱满圆润,折光性、立体感强,神经元细胞轴突长,形状粗壮,数量多,与树突相互交集呈网络状;细胞贴壁牢固,变成大部分神经元胞体与自身轴突、树突连接断裂,有的胞体,细胞直接从培养板壁上脱落,脱落的细胞堆积在一起;从海马神经元OGD损伤时效曲线可发现前5 d海马神经元生长迅速,第5天到达高峰期,第5~7天为平台期,第8天后活力稍下降;与OGD 0 h(正常)OD值比较,OGD 0.5、1、2及3 h的OD值减低(P<0.05),表明所采用的OGD造模方法是成功的,OGD 2 h时细胞的损伤程度为正常细胞组30%,可作为正式实验OGD模型。结论:三气培养箱联合EBSS液可进行体外OGD造模,最佳的细胞模型为培养2 h。

刺五加多糖对氧化损伤大鼠的海马神经元OGG1 mRNA表达的影响

目的研究刺五加多糖(ASPS)对氧化损伤的海马神经元OGG1mRNA表达的影响,为揭示ASPS具有抵抗氧化损伤提供有力的实验依据。方法运用海马神经细胞原代培养技术,采用H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型。观察细胞形态学变化;MTT法测定细胞活性;化学比色法检测细胞匀浆液中过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力;RT-PCR法检测OGG1mRNA的表达。结果形态学观察显示,与模型组比较,ASPS组细胞损伤程度明显减轻;ASPS组细胞活性(0.46)比模型组细胞活性(0.36)高(P<0.01);SOD、GSH-Px活力ASPS组显著高于模型组;ASPS能够明显提高OGG1mRNA的表达。结论ASPS能够增强OGG1mRNA的表达,并对海马神经元氧化损伤有保护作用。

大鼠海马结构有髓神经纤维体视学方法的建立

目的:建立定量研究海马结构及其内有髓神经纤维的无偏体视学方法.方法:选择6 mo龄正常雌性Long-Ev-ans大鼠5只,运用卡瓦列里原理计算海马结构的总体积.根据随机抽样原则在海马结构内切取5～6个组织块,用"球切法"保证满足三维空间内各向同性抽样原则后,切取60 nm厚的超薄切片,在透射电子显微镜下从每张切片随机拍摄15个视野.使用无偏计数框计算海马结构内有髓神经纤维的长度密度;使用等距测点框计算海马结构内有髓神经纤维的体积密度.用长度密度,体积密度分别乘以海马结构的体积,获得海马结构内有髓神经纤维的总长度和总体积.测量与纤维断面的最长轴相垂直的所有横轴中最长的一条横径为其直径.结果:得到大鼠海马结构的平均体积为(85.9±14.0)mm3;海马结构内有髓神经纤维的总长度为(9.1±3.8)km;总体积为(4.3±1.2)mm3;平均直径为(0.7±0.1)μm.结论:本研究建立的体视学方法可为定量研究正常老年及各种神经系统退行性疾病状态下海马结构内有髓神经纤维的改变提供依据.

DP_2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元的作用观察

目的建立麦芽酚铝致原代培养大鼠海马神经元损伤模型,探讨DP2干预对铝负荷原代海马神经元的作用。方法选取孕期18 d左右的SD大鼠,离体培养胎鼠海马神经元,d 7进行NSE免疫组化鉴定,并给予Al(malt)3建立铝负荷致原代培养大鼠海马神经元损伤模型,同时分别给予DP2激动剂DK-PGD2和DP2拮抗剂CAY10471进行干预。继续培养24 h后,检测各组海马神经元MTT值、LDH漏出率和Ca2+荧光强度,HE染色观察神经元病理形态变化。结果海马神经元纯度超过95%。与空白对照组比较,铝负荷模型组MTT值明显降低(P<0.01);LDH漏出率明显升高(P<0.01);Ca2+荧光强度明显增强(P<0.01);神经元细胞数目明显减少,突起萎缩甚至消失,部分细胞核固缩。与铝负荷模型组比较,DP2激动剂DK-PGD2干预组MTT值明显降低(P<0.01、P<0.05);LDH漏出率明显升高(P<0.01);Ca2+荧光强度有增强趋势,但差异无显著性;海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解。DP2拮抗剂CAY10471干预组MTT值明显升高(P<0.01);LDH漏出率明显降低(P<0.01);Ca2+荧光强度明显减弱(P<0.01)。海马神经细胞胞体、胞核明显,裂解细胞明显减少。结论 DP2激活表达可增加神经元对铝盐损伤的易感性。

改良的新生大鼠海马脑片缺氧缺糖模型的制备方法

目的：介绍一种经济实用的海马脑片缺氧缺糖模型的制备方法。方法：选出生8～10d的SD乳鼠，分离大脑海马．切成400μm厚的脑片，转至带有Millicel微孔膜插件的培养皿中。分别培养7d、14d、20d和30d，倒置显微镜观察形态。碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）染色后荧光显微镜下检测脑片活力。充入氮气于不同时相点观察脑片缺氧状况。结果：①培养7d和14d的脑片中所有细胞PI染色呈阴性，培养30d时脑片中部分神经元PI染色阳性，细胞变性坏死。②充入氮气时间越长．海马脑片的死亡细胞越多。⑧充入氮气1．5h后正常培养24h可观察到海马脑片CA1、CA3、DG均出现强荧光显色。结论：脑片存活时间约30d．充入氮气1．5h可建立稳定的缺氧缺糖模型。

切割穹隆海马伞海马提取液促进放射状胶质细胞增殖和向神经元分化

目的探讨海马微环境的变化对体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化的影响。方法本实验在成功制备正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液的基础上,分别使用正常侧和切割侧海马提取液,观察其在体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化过程中所起的作用。结果在放射状胶质细胞增殖阶段,切割组与正常组及对照组相比,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的增殖细胞比例明显提高(P<0.05);在放射状胶质细胞分化阶段,切割组与正常组及对照组相比,Tuj1阳性神经元数量明显增多(P<0.05)。结论切割穹隆海马伞侧海马提取液对大鼠放射状胶质细胞的增殖和向神经元的分化有明显促进作用,提示海马微环境对海马放射状胶质细胞的增殖和分化有重要影响。

海马硬化所致颞叶癫痫SPECT与MRI脑血流灌注对照研究

目的通过应用单光子发射断层扫描(single-photon emission tomography,SPECT)脑血流灌注显像及动脉自旋标记(arterial spin labeling,ASL)脑血流灌注成像技术对海马硬化(hippocampal sclerosis,HS)所致颞叶癫痫(intractabletemporal lobe epilepsy,TLE)患者脑血流灌注,特别是海马区血流灌注进行定性及半定量测量,并比较其相关性。方法搜集经手术及病理证实为HS的18例TLE患者。选择性别、年龄匹配的21例健康志愿者作为对照组。18例患者及3例健康志愿者行SPECT脑血流灌注显像,全部患者及志愿者行ASL脑血流灌注成像。对HS所致TLE患者脑内,特别是海马区的血流灌注进行定性及定量分析,分别比较应用两种血流灌注方法(SPECT、ASL)测得的HS患者病变侧、对侧及与对照组海马区rCBF的差异。结果应用SPECT及ASL两种脑血流灌注显像技术测得HS所致TLE患者病变侧海马区rCBF均较对侧减低,病变侧与对侧海马区rCBF有显著性差异(P <0. 01);病变侧海马区rCBF较对照组明显减低,病变侧与对照组海马区rCBF有非常显著性差异(P <0. 01);对侧与对照组海马区rCBF有无显著性差异(P> 0. 05)。结论SPECT脑血流灌注显像和ASL脑血流灌注成像技术定性分析HS所致TLE脑血流灌注改变一致性较好,均证实HS所致TLE病变侧海马区血流灌注减低。

氯胺酮对SD幼鼠海马GAP-43蛋白的影响

目的观察氯胺酮对7d龄SD幼鼠海马神经元细胞GAP-43表达的影响。方法对7d龄SD幼鼠注射氯胺酮25mg/kg(k1组)、50mg/kg(k2组),对照组注射生理盐水50 ml/kg(k0组),24h后取材,采用免疫组化染色和Western blot技术检测SD幼鼠海马GAP-43蛋白的表达,进行图像分析。结果注射氯胺酮后24h,免疫组化染色GAP-43蛋白阳性细胞计数:k0组为(85.4±15.2)个/mm2,k1组为(67.6±11.5)个/mm2,k2组为(36.6±9.7)个/mm2。Western blot GAP-43蛋白电泳条带灰度值k0组为186.375±7.45,k1组为165.754±7.012,k2组为158.852±8.721。k1组和k2组GAP-43蛋白的表达明显减少。结论注射氯胺酮后24h,SD大鼠海马神经元细胞GAP-43蛋白的表达下调,可能和氯胺酮神经毒性有关。

中国人脑立体定位MRI海马结构体积的测定

目的测量标准立体定位空间获得的健康中国人脑MRI海马结构的体积，为应用体积测量方法早期诊断颞叶癫痫等疾病提供影像学的参考标准。方法在标准立体定位空间对100例健康中国人脑进行T1加权像MRI扫描，在冠状位MRI上应用软件测量海马结构的体积，并进行相关统计学分析。结果在标准立体定位空间MRI能够较清晰、真实的显示海马结构。男女海马结构体积分别为2981．39±297．47mm^3和2970．43±330．13mm^3，性别之间海马结构的体积差异无显著性意义（P〉0．05）；左右侧体积分别为2949．67±327．06mm^3和3001．81±298．97mm^3，左右侧海马的体积存在显著性差异（P〈0．05）．右侧大于左侧。在20-29岁、30-39岁、40～49岁、50-59岁组间MRI海马结构的体积差异无显著性意义（P〉0．05），而20～29岁、30～39岁、40-49岁、50-59岁组与60-69岁组间经统计学分析发现具有显著性差异（P〈0．05），60岁以后，海马体积逐渐缩小。结论在标准立体定位空间获得的海马结构体积与性别无关，右侧海马结构体积大于左侧（P〈0．05）。60岁以后，海马结构体积随年龄增加而逐渐缩小，因此在MRI影像学诊断海马结构病变时应给予重视。

大鼠惊厥持续状态及培养海马神经元惊厥样放电后的BDNF表达研究

目的:结合在体和体外实验,探索脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在惊厥发作后表达的变化。方法:建立生后20天幼年(IRs)及2～3月健康成年(ARs)Wistar大鼠惊厥持续状态(Status convulsion,SC)模型、原代培养海马神经元惊厥样放电模型,采用免疫组化、ELISA对SC后6个时点大鼠海马、惊厥样放电后海马神经元BDNF的表达变化进行观察分析。结果:(1)SC后大鼠海马各区BDNF阳性着色均有不同程度的增强,以齿状回更为明显;幼年鼠海马BDNF含量在SC后3h即显著增加(从惊厥前的6.65±1.60pg/μg升至11.22±2.44pg/μg)(P<0.05),至惊厥后1天达到高峰,继之逐渐回落,SC后3天仍显著高于发作前水平,7天接近正常;成年鼠海马BDNF在SC后1天显著增加(从惊厥前的5.91±1.63pg/μg升至13.37±5.61pg/μg)(P<0.05),至惊厥后3天达到高峰并高于同时点幼年鼠(P<0.05),之后逐渐下降,持续7天左右。(2)原代培养海马神经元惊厥样放电后24h细胞样本BDNF表达显著高于对照组(P<0.05)。结论:惊厥发作在动物和细胞模型均引起了自身BDNF的高表达,可能是海马神经元对惊厥损伤的内源性保护反应。幼年与成年大鼠海马惊厥后的BDNF表达在反应速度、维持程度上的差异性可能与未成熟脑对自身的保护性反应有关。

蝎毒耐热蛋白对原代培养海马神经元NPY表达的影响

探讨具有抗癫痫反复发作作用的蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat-resistant protein,SVHRP)对大鼠海马神经元神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达的影响。采用免疫细胞化学ABC法与HPIAS系列彩色病理图文定量分析系统相结合,检测NPY-免疫阳性产物(NPY-IR)表达的变化,用RT-PCR技术观察NPY mRNA表达水平的变化。终浓度范围为0.2、2、20和200μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育24h后,NPY阳性神经元的反应强度明显增强,具有剂量-反应关系。终浓度为20μg/ml的SVHRP分别与培养10d的海马神经元共孵育3、6、9、12和24h,NPY阳性反应强度增强,并呈时间-反应关系。RT-PCR结果显示,20μg/ml的SVHRP与原代培养海马神经元共孵育24h后,NPY mRNA的表达明显增加。以上结果提示SVHRP可诱导原代培养海马神经元NPY阳性反应和NPY mRNA的表达。

癫痫持续发作对大鼠海马神经元的影响

目的研究实验性癫痫大鼠在癫痫发作持续不同时间对海马神经元的影响.方法24只SD大鼠随机分成4组:诱发大鼠癫痫持续状态(status epilcpticus,SE)＜10、10～30、＞30 min组及正常对照组.于电镜下观察各组海马神经元超微结构变化;采用免疫组化方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达及通过流式细胞技术检测细胞凋亡情况.结果SE＜10 min组海马神经元所受影响不大,SE 10～30 min组海马神经元具有明显凋亡特征,SE＞30 min组多数海马神经元呈坏死性改变.结论大鼠SE对海马神经元损伤有凋亡和坏死两种不同形式,这与癫痫发作的持续时间密切相关.

逍遥散对应激大鼠海马突触体内PKC活性及Ca^(2+)浓度的影响

目的:探讨逍遥散对慢性心理应激大鼠海马突触体内Ca2+浓度及蛋白激酶C(PKC)活性的影响,进一步研究其对心理应激损伤学习记忆保护作用的机制。方法:Wistar大鼠随机分为五组,采用慢性多相性应激模型,以Fura-2负载及荧光分光光度计检测大鼠海马突触体内Ca2+浓度,采用琼脂糖凝胶电泳法检测突触体内PKC活性。结果:两个模型组大鼠海马突触体内Ca2+浓度及PKC活性均有上升(P<0.01),而逍遥散组与模型组比较,突触体内Ca2+浓度及PKC活性则明显回落(P<0.05或P<0.01)。结论:慢性多相性应激可升高大鼠海马突触体内Ca2+浓度及PKC活性,逍遥散具有对抗应激升高大鼠海马突触体内Ca2+浓度及PKC活性的作用。

脑源性神经营养因子及酪氨酸激酶B受体在大鼠海马结构CA_1区的表达研究

目的研究脑源性神经营养因子（BDNF）及酪氨酸激酶B（TrkB）受体在大鼠海马结构CA1区时空分布变化。方法采用免疫组织化学实验，观察BDNF及TrkB在正常大鼠发育期、成年期和老龄期海马结构CA1区的定位分布及时间变化。结果BDNF，TrkB在海马结构的时空表达基本一致。生后0d，CA1颗粒层上片染色较深，细胞轮廓隐约可见。成年期，细胞染色增强，轮廓清晰，核大而圆无着色；老年期，阳性细胞数量开始下降，染色变淡，CA1锥体阳性细胞层变薄，染色淡。细胞轮廓不清，阳性细胞发生了明显退行性变。结论海马结构内BDNF，TrkB主要表达于CA1区的锥体细胞层，表达高峰均为生后15～20d。老年期呈明显的增龄性下降，阳性细胞发生退行性变化。

还脑益聪方对老龄认知障碍大鼠脂质代谢和海马内质网Aβ相关结合蛋白表达的影响

目的:观察还脑益聪方对老龄认知障碍-痴呆(AD)大鼠学习记忆、脂质代谢和海马内质网Aβ相关结合蛋白(ERAβ)表达的影响。方法:利用Morris水迷宫筛选老龄认知障碍大鼠40只,按随机表分为还脑益聪方大剂量(13.68g生药/kg)组、小剂量(6.84g生药/kg)组、阳性药物对照组(盐酸多奈哌齐片,0.45mg/kg)组和模型(认知障碍老龄大鼠)对照组,每组10只,灌胃给药8周,观察大鼠学习记忆行为,血脂指标和海马组织病理形态及免疫组化ERAβ表达的变化。另设健康青年组大鼠10只和健康老年组大鼠10只作为对照组。结果:与青年组大鼠比较,老龄认知障碍大鼠的血脂水平增高(P<0.05),海马组织病理形态改变明显,ERAβ表达显著增高(P<0.01)。与老龄认知障碍模型大鼠比较,还脑益聪方能显著缩短AD大鼠寻台时间和寻台路线(P<0.01,P<0.05),降低血清胆固醇的水平(P<0.01),改善大鼠海马组织的病理形态,抑制大鼠海马ERAβ的表达。结论:还脑益聪方具有调节老龄痴呆大鼠的血脂水平,抑制ERAβ的表达,从而减轻海马区神经元损伤,提高老龄认知障碍大鼠的学习记忆能力。