恶性疟原虫HRPⅡ基因的克隆与表达

采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ基因，经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体，并转化大肠杆菌ＴＧ１。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＨＲＰⅡ融合蛋白的表达。采用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析对表达产物进行鉴定。结果显示ＨＲＰⅡ基因与ｐＷＲ４５０－１重组后在大肠杆菌ＴＧ１中表达一６８ＫＤａ的融合蛋白，当工程菌ＯＤ５９０为１．０～１．２时，加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导，表达量较高。

抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白 (HRP- )融合表达蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,取脾细胞与 SP2 / 0细胞融合 ,经 3次 EL ISA筛选 ,共获得 6株分泌抗恶性疟原虫重组 HRP- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1B11、1D10、2 E7、3A3、3F9、4G5 ) ,用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养 ,并用杂交瘤细胞经腹腔接种 BAL B/ c小鼠制备腹水。 6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (Mc Ab)经琼脂双扩散鉴定均为 Ig G1亚类 ,Dot- EL ISA及 Western blot分析显示 6株 Mc Ab都能与重组 HRP- 抗原发生特异性反应 ,但其中只有 2 E7和 3A3在 Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然 HRP-

恶性疟原虫现场样品HRP-Ⅱ基因部分序列分析

目的 分析和比较不同地理株恶性疟原虫现场样品及我国恶性疟原虫现场样品与实验室培养虫株在HRP Ⅱ基因上的多态性。 方法 分别以在中国感染的恶性疟病人和在非洲感染的恶性疟病人全血为材料 ,PCR扩增HRP Ⅱ基因片段 ,扩增的产物分别克隆于 pUCm T载体并进行测序 ,用GENEDOC软件比较分析核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性。 结果 从中国海南省和云南省恶性疟病人血样中扩增出序列和长度完全相同的片段 ,大小为44 7bp ;从在非洲感染的恶性疟病人血样中扩增出 813bp的片段 ;中国恶性疟原虫实验室培养株相应核苷酸序列长度为870bp。从中国恶性疟病人血样扩增出的HRP Ⅱ基因片段序列与从非洲恶性疟病人血样扩增出的HRP Ⅱ基因片段序列及我国恶性疟原虫培养株相应的核苷酸序列相比 ,不但有多个长短不等序列的缺失和插入 ,还有多个碱基发生了突变 ;比较推导的氨基酸序列 ,除了有多个长短不等氨基酸序列的缺失和插入外 ,其他氨基酸残基没有发生改变。 结论 恶性疟原虫HRP Ⅱ基因在不同地理株间存在差异 ,在同一地理株的实验室培养株与现场样品间也存在差异 。

恶性疟原虫反义HRPⅡ基因荧光真核表达重组质粒的构建

目的 构建恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )反义真核表达载体 ,为研究HRPⅡ反义核酸的抗疟作用奠定基础。方法 应用基因重组技术 ,将我们已经克隆的恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19反向亚克隆入荧光真核表达载体pEGFP N3,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌 ,阳性重组子经HindⅢ和SacⅠ双酶切分析、PCR鉴定。结果 恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19重组质粒中 ,成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP N3,获得了反义HRPⅡ /pUC19重组质粒。结论 恶性疟原虫HRPⅡ基因以反方向亚克隆入pEGFP N3质粒 ,成功构建反义HRPⅡ /pEGFP N3荧光真核表达载体 ,解决了HRPⅡ反义核酸来源问题 ,为下一步研究反义HPRⅡ的抗疟作用奠定了基础。

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ、Ⅲ的序列多态性分析

目的分析恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ/Ⅲ（Pf HRPⅡ/Ⅲ）的序列多态性。方法采集云南疟疾流行区恶性疟患者血样20份,血涂片后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂检测（RDTs）,同时提取各血样中恶性疟原虫基因组DNA,进行PCR扩增Pfhrp2和Pfhrp3核酸片段并测序。使用Bioedit软件对Pfhrp2和Pfhrp3基因序列进行比对,使用TRANSEQ软件推导出其编码的氨基酸序列。结果 20份血样经镜检和RDTs检测均为恶性疟原虫阳性。PCR扩增结果显示,各血样的Pfhrp2核酸片段约389～986 bp,Pfhrp3核酸片段大小约329～640 bp,应用测序获得的核酸序列推导出相应的氨基酸序列,Pf HRPⅡ氨基酸残基序列以1型（AHHAHHVAD）起始并最终以12型（AHHAAAHHEAATH）作为结尾,Pf HRPⅡ特征性氨基酸残基重复序列数量相对较多的分别有7型（AHHAAD）、2型（AHHAHHAAD）和6型（AHHATD）;Pf HRPⅢ含有重复较多的型别是16型（AHHAAN）和17型（AHHDG）;Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ均未发现11型（AHN）。结论 20份恶性疟患者血样中Pfhrp2和Pfhrp3存在诸多的核酸变异,Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ共享一些特征性重复序列。

血管紧张素Ⅱ上调血管平滑肌细胞富含半胱氨酸蛋白61的表达

目的探讨血管紧张素Ⅱ对培养鼠血管平滑肌细胞富含半胱氨酸蛋白61的影响及其可能的转导通路。方法组织贴块法培养血管平滑肌细胞,血管紧张素Ⅱ处理平滑肌细胞15min、30min、60min、180min,PD98059在血管紧张素Ⅱ刺激细胞前1h加到培养基中,用逆转录聚合酶链反应和Westernblotting检测分析富含半胱氨酸蛋白61的表达。结果逆转录聚合酶链反应分析显示用1μmol/L血管紧张素Ⅱ刺激细胞培养15min、30min富含半胱氨酸蛋白61的表达与对照组相比明显增加;同时细胞外信号调节激酶1/2活性高于对照组(P<0.01),60min时仍有表达,180min时减弱;细胞外信号调节激酶1/2特异性抑制剂PD98059(20μmol/L)能阻断血管紧张素Ⅱ上调富含半胱氨酸蛋白61的表达并抑制增加的磷酸化细胞外信号调节激酶1/2活性。结论血管紧张素Ⅱ通过细胞外信号调节激酶1/2促进血管平滑肌细胞上调富含半胱氨酸蛋白61表达,这可能是血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖的一个重要机制。

自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫HRP-II抗原的评价

目的对自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)的敏感性、特异性、稳定性等技术参数进行评价,为试剂盒的临床应用提供科学依据。方法对试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、精密度、稳定性等性能指标进行测定,并与国外的同类试剂盒进行比较研究。结果自制试剂盒操作简便,反应快速;以血涂片显微镜检查为金标准,对49例恶性疟血样、30例间日疟血样、43例正常人血样检测的敏感性为98%,特异性为100%;对恶性疟原虫血样的最小检出量为原虫密度0.01%,对重组HRP-II蛋白的最小检出量为10ng/ml;试剂盒精密度和稳定性均较好;各项性能指标相当或优于国外同类试剂盒。结论自行研制的恶性疟原虫免疫层析检测试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠,适用于恶性疟的快速诊断、流行病学筛查、疟区献血员筛查及过境边民筛查。

单克隆抗体3A3、2E7用于恶性疟Dipstick检测的初步研究

目的 建立一种快速、简便 ,适用于基层的恶性疟免疫诊断方法。 方法 将抗恶性疟原虫 HRP- 的单克隆抗体 3A3、2 E7纯化后经配对筛选 ,利用 Dipstick-免疫胶体金技术 ,制成诊断恶性疟的 Dipstick层析条。用该层析条对 115份疟疾患者血样 ,2 0份非疟疾病人血样及 10份正常人血样进行检测 ,评价其敏感性和特异性 ,并对其稳定性、重复性等进行了初步研究。 结果 用该法检测 145份血样 ,其对恶性疟的敏感性和特异性分别为 83.1%及 97.5 % ,已包被抗原、抗体的 Dipstick条在 4℃及室温下可保存 3个月以上 ,对 30份血样重复检测 4次结果完全一致。 结论 Dipstick-免疫胶体金模式快速、简便 ,适用于基层应用 。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。

检测恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的疟疾诊断免疫层析试条的研制与评价

目的建立一种快速、简便的诊断恶性疟的胶体金免疫层析试条方法，并对其进行评价。方法克隆、表达恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ基因，以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，筛选恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ特异的单克隆抗体．分别作为包被抗体和标记抗体．制备免疫层析试条。用该试条检测流行区非疟疾发热患者血样80份、内脏利什曼病患者血样20份和确诊的间日疟患者血样75份以评价其特异性：检测确诊的恶性疟患者血样89份．以评价其敏感性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ．用重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体．采用杂交瘤技术共筛选出5株能高效分泌特异抗体的细胞株（效价为1：12800～1：102400），抗体亚类均为IgG1。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白组分．而与疫区非疟疾发热患者的红细胞组分无交叉反应。以筛选到的单克隆抗体制备的免疫层析试条检测疫区非疟疾发热患者、内脏利什曼病患者和间日疟患者血样的特异度为97．7％（171／175），其中20份内脏利什曼病患者血样全部为阴性。检测恶性疟患者血样敏感度为95．5％（85／89）。结论制备了能识别天然恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的特异性单克隆抗体，以此单抗为基础研制出的快速诊断恶性疟的胶体金免疫层析试条敏感度、特异度均较高。

烟尘慢性染毒致肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化离体实验研究

目的建立模仿肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)暴露于云锡炼厂烟尘环境的离体研究模型。方法以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高、低剂量染毒组和空白对照组。前2组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养。从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性。采用透视电镜观察细胞超微结构,流式细胞术观察细胞周期,免疫印迹法及免疫组织化学观察各组细胞肺表面活性蛋白(SP)-B、SP-C、鼠双微体2(MDM2)蛋白、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白的改变。结果染毒24 h后即可观察到烟尘对RLE-6TN细胞超微结构造成损伤,主要表现为板层小体变性且数量减少,以及细胞凋亡和坏死;转化后的细胞由圆形或类圆形铺路石样生长变为长梭形。高、低剂量染毒组细胞培养至25代时软琼脂克隆形成检测实验均呈阳性,克隆形成率分别为3.33‰和1.67‰;继续培养至35代观察高、低剂量染毒组克隆形成率分别为12.50‰和10.00‰,空白对照组始终没有克隆形成。高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P<0.01),但与烟尘染毒剂量相关性无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪检测示高、低剂量染毒组G2/M期+S期的比例较空白对照组增高。高、低剂量染毒组第25、30代细胞MDM2蛋白阳性、SP-B及FHIT蛋白阴性,而空白对照组同代细胞MDM2蛋白阴性、SP-B及FHIT蛋白阳性。高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞示SP-C失表达,空白对照组SP-C有表达。结论 ATⅡ长期暴露于云锡炼厂烟尘中可导致其恶性转化。ATⅡ特异性蛋白SP-B、SP-C、FHIT失表达,MDM2阳性表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标。

光下D1/D2/Cytb559复合物中氨基酸残基的破坏和多肽的降解

光系统Ⅱ反应中心Ｄ１／Ｄ２／Ｃｙｔ ｂ５５９ 复合物对光照十分敏感。不仅色素分子，而且多肽链上的氨基酸残基（如组氨酸和甲硫氨酸）均会受到破坏。光照同时引起Ｄ１ 和Ｄ２ 蛋白的降解。在ＳＤＳ聚丙烯酰胺多肽电泳图谱上，Ｄ１／Ｄ２ 二聚体的含量增多，同时有一条分子量大约为４１ ｋＤ的新带出现。在光照后的暗放置过程中，氨基酸组成不再变化，但Ｄ１ 和Ｄ２ 蛋白的降解及大分子量片段的产生仍继续进行。对组氨酸和甲硫氨酸的破坏与Ｄ１、Ｄ２ 蛋白的降解关系进行了初步的分析，推测在光破坏过程中，Ｄ１ 和Ｄ２

恶性疟原虫:组氨酸富集蛋白基因反义寡脱氧核苷酸体外抗疟作用初步研究

[目的 ]研究反义寡脱氧核苷酸 (oligodeoxyribonucleotides,ODN)对恶性疟原虫组氨酸富集蛋白 (histidine richprotein ,HRP)Ⅱ和HRPⅢ基因表达的阻断作用 ,探讨抗疟新途径。 [方法 ]设计合成恶性疟原虫组氨酸富集蛋白翻译起始区的反义ODN、正义ODN和无义ODN ,研究其对红内期培养恶性疟原虫增殖和成熟的体外抑制作用。[结果 ]当ODN浓度较高时 (高于 1μmol L) ,反义ODN、正义ODN和无义ODN均能抑制恶性疟原虫的增殖和成熟 ,即ODN对疟原虫呈非特异性抑制。当ODN浓度在 0 0 1～ 0 5 μmol L时 ,与无义ODN对照组相比 ,反义ODN能显著抑制体外培养恶性疟原虫的增殖和裂殖体成熟 (P <0 0 1) ;且ODN浓度越高 ,抑制作用也就越强。正义ODN对虫体的抑制作用 ,与无义ODN相比其差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。 [结论 ]HRPⅡ和HRPⅢ基因反义ODN可通过阻断基因的表达 ,抑制恶性疟原虫增殖和成熟的作用。

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)扩增HRPⅡ全编码区基因 ,经HindⅢ和BamHI双酶切后定向克隆入带CMV启动子的真核高效表达载体 pcDNA3,构建HRPⅡ /pcDNA3重组载体 ;用脂质体法将重组载体转染HepG2肝癌细胞 ,经G418加压筛选后 ,收集阳性克隆细胞培养上清 ,表达产物进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果 成功构建HRPⅡ / pcDNA3真核表达载体 ,SDS PAGE和Western免疫印迹分析表明 ,HRPⅡ表达产物相对分子质量约 35 0 0 0 ,呈分泌性表达 ,且表达产物能被抗HRPⅡ单克隆抗体特异识别。

云南恶性疟病例疟原虫Pfhrp2基因序列多态性分析

目的：分析云南省恶性疟病例疟原虫虫株的富组氨酸蛋白Ⅱ（Histidine？rich protein？2，HRPⅡ）基因（Pfhrp2）序列的多态性，为研究疟原虫抗原基因缺失奠定基础。方法搜集2012年8月-2015年9月云南省恶性疟现症病例的滤纸血样和相关信息，用PCR技术扩增血样中恶性疟原虫Pfhrp2基因exon2区并测序，测序成功序列与AY816237、AY816240、AY816301参比序列比对；用Mega 5.04分析Pfhrp2基因exon2区序列多态性，计算序列间保守位点、遗传距离等；根据氨基酸序列间遗传距离绘制聚类树状图。结果共收集云南省15个州（市）的恶性疟现症病例血样218份，病例感染来源地包括云南本地、非洲、缅甸等流行区。其中155份Pfhrp2基因exon2区扩增阳性和测序成功，编码氨基酸数在115～298之间，平均为239.7 aa，非洲（239.9 aa）、缅甸（239.5 aa）、云南（241.6 aa）感染虫株的氨基酸残基均数差异无统计学意义（F=0.025，P＆gt;0.05）。所有氨基酸残基序列均以12型重复作为结尾，以1型、2型重复为起始，比例各占98.1%（152/155）和1.9%（3/155），2型重复次数最多，为12.9次。155条Pfhrp2基因exon2区DNA序列的同源位点为894 bp，保守位点占20.8%（186/894），变异位点占78.2%（699/894），非洲虫株序列间遗传距离为0.000～0.741，缅甸为0.000～0.948，云南为0.000～0.750。所有155条序列按氨基酸序列大小聚类成3个大类，同一个层级的序列具有近似的序列长度和氨基酸重复类型。结论云南省恶性疟现症病例所感染疟原虫的Pfhrp2基因exon2区存在高度多态性，恶性疟原虫株主要按Pfhrp2基因exon2区的氨基酸序列长度进行聚类。

恶性疟原虫体外药敏实验检测方法的比较研究

目的比较WHO微量测试法（WHO microtest）、疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodial lactate dehydrogenase,p LDH）ELISA测定法、富组蛋白Ⅱ（Histidine-rich proteinⅡ,HRPⅡ）ELISA测定法和SYBR GreenⅠ荧光测定法等4种恶性疟原虫体外药敏实验检测方法,确定一种较为稳定、简便快速且经济的体外药敏实验检测方法,用于后续疟原虫敏感性的监测及新型抗疟药的筛查。方法以恶性疟原虫虫株3D7、FCC、K1、Dd2为对象,分别采用WHO microtest法、p LDH法、HRPⅡ法和SYBR GreenⅠ法测定其对氯喹、哌喹和阿莫地喹的敏感性,并采用Friedman检验、偏相关分析、Pearson相关分析和Bland-Altman分析对4种药敏检测方法的IC50值进行分析。结果在初始密度为0.5%~1.0%时,4种方法的IC50值之间的差异无统计学意义（P〉0.05）,任意2种方法间均呈直线相关关系（P〈0.001）。WHO microtest法技术要求高、耗时长且结果判定受主观影响;HRPⅡ法的敏感性高于p LDH法和SYBR GreenⅠ法,但成本高;SYBR GreenⅠ法技术要求低、耗时短且成本低。结论 SYBR GreenⅠ法是一种较为便捷、经济的检测方法,适用于大规模监测疟原虫药物敏感性及研究新型抗疟药。

艾博混合疟/恶性疟快速诊断试剂效果评价

目的评价艾博混合疟/恶性疟(Malaria Pan./p.f..)快速诊断试剂的检测效果。方法采集疟疾、疑似疟疾、不明原因发热及感冒"四热"患者血样,以显微镜镜检方法为金标准,比较艾博混合疟/恶性疟试剂检测效果结果共采集584份血样,艾博试剂检测恶性疟原虫277份,灵敏度为98.9%,特异性为97.7%,与显微镜符合率为98.3%。艾博试剂检测混合疟377份的灵敏度为99.5%,特异性为99.0%,与显微镜符合率为99.3%,总符合率为98.8%,上述2方面的检测结果经Kappa一致性检验,Kappa值均大于0.97。结论艾博混合疟/恶性疟试剂盒实验室检测敏感性和特异性高,能检测混合疟并区分恶性疟,结果与血涂片吉氏染色镜检结果高度一致,适用于疟疾流行的基层使用。