K88ac^+和K88ad^+产肠毒素大肠杆菌hlyA基因缺失株的构建及相关功能初步分析

为研究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)溶血素hlyA基因的相关生物学特性,本研究通过Red同源重组的方法构建了ETEC标准株K88ac+C83902和K88ad+C83903的hlyA基因缺失株。体外生长试验和酵解试验表明:缺失株C83902△hlyA和C83903△hlyA生长速度及生长周期各个阶段的特性与相应野生株相比无差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变。小鼠感染试验显示经野生株和回补株感染的小鼠致死率高,而缺失株不致死,表明hlyA基因可以增强ETEC对ICR小鼠的致病力。从感染小鼠的十二指肠、空肠、回肠分离感染的靶细菌,平板计数和PCR检测表明,ETEC在小鼠回肠的黏附能力强于在十二指肠和空肠,并且基因缺失株黏附能力比野生株显著降低。本研究首次对ETEC溶血素hlyA基因进行研究,为进一步阐释α-溶血素与机体相互作用的分子机制和ETEC的致病机制,以及预防ETEC感染提供了相关的实验依据。

单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因序列及溶血素活性测定

从3株不同来源的单核细胞增多性李斯特菌中PCR扩增溶血素编码基因hlyA,连接到T克隆载体转化到受体菌DH5α中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定后测序,对测定的hlyA基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,从3个菌株克隆的hlyA基因具有完整的开放阅读框,同源性在96.9%以上;其推导的LLO氨基酸序列同源性在97.9%以上,N端存在相同的PEST基序,C端存在相同的保守性11肽结构。建立和运用分光光度法对3个试验菌株的溶血素活性进行了检测,结果表明,在pH5.6时LLO溶血活性最高,在pH7.0时LLO溶血活性基本丧失。本试验单核细胞增多性李斯特菌的流行病学分析和基因工程疫苗载体研究提供了依据。

气单胞菌aerA和hlyA两基因在溺死诊断中的应用

目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlyA)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlyA-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlyA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlyA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论基于气单胞菌aerA基因和hlyA基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。

纳米微悬臂梁传感器快速检测李斯特细菌毒力基因hlyA

目的利用纳米微悬臂梁传感器对李斯特细菌毒力基因溶血素基因(hlyA)进行无标记检测,初步研究这种新型传感技术在基因检测中的应用。方法利用聚合酶链反应技术(PCR)特异性扩增单核增生性李斯特细菌溶血素基因(hlyA),采用自组装单分子膜将DNA探针分子固定在悬臂梁的表面,采用XPS(X射线光电子能谱)进行验证。结果完成表面修饰后,实现了对李斯特细菌毒力基因hlyA基因的无标记检测,最低检测限为0.1μg/mL。结论传感器性能稳定,特异性好,反应迅速。

李斯特细菌hlyA的原核表达与纯化

目的构建李斯特细菌毒力基因原核表达质粒,并诱导其表达纯化并鉴定目的蛋白。方法构建李斯特溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的原核表达载体PGEX/3X,并利用Factor Xa切割了GST标签,酶切正确后构建重组原核表达质粒,并转化到大肠杆菌,IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blot鉴定。结果目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因GenBank登陆的序列完全一致,重组质粒经IPTG诱导表达相对分子量为60 kD的目的蛋白;Western blot鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗LM抗体特异性结合。结论成功构建了重组原核表达质粒,并纯化获得高纯度的LLO蛋白。

霍乱弧菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

原核表达、纯化霍乱弧菌HlyA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。PCR扩增霍乱弧菌hlyA基因并克隆入pET28a、pET32a和 pCold TF载体中构建重组表达载体;将重组载体pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA转化E.coil BL21(DE3)中,进行表达条件优化及表达形式鉴定。获取可溶性形式的HlyA蛋白行Ni-NTA柱纯化,纯化的HlyA蛋白免疫BALB /c小鼠以制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测抗体效价,以评估其免疫原性。再以Western blot法分析抗体对霍乱弧菌中HlyA蛋白的特异性识别,并行质谱验证。分析纯化的HlyA蛋白的溶血活性及其抗体的中和活性。pET28a-hlyA、pET32a-hlyA载体只能诱导出包涵体表达的HlyA蛋白,pCold TF-hlyA载体诱导出可溶性表达的HlyA蛋白。经Ni-NTA柱纯化后获得较纯的HlyA蛋白,该蛋白不能裂解兔红细胞,但免疫小鼠可获得较高效价的多克隆抗体;Western blot和质谱鉴定均显示HlyA多克隆抗体能特异性识别霍乱弧菌中的HlyA蛋白,且该抗体可有效抑制霍乱弧菌分泌上清液的溶血活性。成功获得可溶表达的HlyA蛋白,免疫小鼠后获得高效价的抗HlyA多克隆抗体,为后续研究HlyA蛋白在霍乱弧菌致病过程中的作用奠定了基础。

FHA结构域蛋白TagH对霍乱弧菌肠道定植能力及致病力的影响

目的探究FHA结构域蛋白TagH对非O1/非O139群霍乱弧菌肠道定植能力和致病力的影响,并探讨这种影响是否依赖于溶血素HlyA和蛋白酶PrtV的表达。方法通过生长曲线实验测定各菌株的生长速率。取CD1乳鼠和CD1小鼠各分为PBS阴性对照组、WT菌株感染组、ΔtagH菌株感染组、ΔtagHΔhlyA菌株感染组和ΔtagHΔprtV菌株感染组,通过乳鼠肠道定植实验分析各菌株的肠道定植能力;通过小鼠灌胃感染实验测定各菌株感染组小鼠外周血白细胞数量以及IL-6、IL-8和TNF-α水平;观察各菌株感染组小鼠回肠组织病理损伤及7 d的生存情况。结果细菌生长曲线实验发现,各菌株的生长速度基本一致并无明显差异。乳鼠肠道定植实验发现,与WT菌株相比,ΔtagH菌株的肠道定植能力增强(P<0.01),ΔtagHΔhlyA菌株的肠道定植能力较ΔtagH菌株进一步增强(P<0.05),ΔtagHΔprtV菌株的肠道定植能力弱于ΔtagH菌株(P<0.05)。小鼠灌胃感染实验发现,与WT菌株相比,ΔtagH菌株的白细胞数升高(P<0.05)且肠组织损伤更严重,ΔtagHΔhlyA菌株的白细胞数较ΔtagH菌株明显下降(P<0.05)且几乎没有肠组织损伤,ΔtagHΔprtV菌株感染现象与ΔtagH菌株相似。WT菌株感染组、ΔtagH菌株感染组、ΔtagHΔhlyA菌株感染组和ΔtagHΔprtV菌株感染组的小鼠生存率分别为62.5%、75%、100%和75%。结论TagH抑制霍乱弧菌的肠道定植能力和致病力,其调控作用主要依赖于霍乱弧菌溶血素HlyA,而蛋白酶PrtV的作用不明显。

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的:建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法:针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果:所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^(-1),且与其他菌株核酸无交叉反应。结论:成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。

实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌。为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性。结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应。单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml。而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml。人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml。此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查。

单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR检测方法建立

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列和金黄色葡萄球菌的nuc基因序列各设计一对引物和一条探针,建立基于TaqMan探针的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法。该方法对所有目标菌株均产生特异性扩增曲线,其他非目标菌均不产生扩增曲线,具有较强的特异性。且该法对阳性重组质粒pMD18-hlyA和pMD18-nuc同时定量扩增的敏感度分别为19.5拷贝/μL和18.7拷贝/μL。同步检测人工染菌肉样中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的最低检出限均为102CFU/g。

鱼致病性舒伯特气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为快速准确鉴别检测鳢源致病性舒伯特气单胞菌(A.schubertii),本实验根据该菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)的保守序列设计引物,建立了检测致病性A.schubertii的双重PCR方法。结果显示gyrB和hlyA基因扩增产物分别为601 bp和375 bp;其最低检出菌体DNA量为2.3×10-2ng,最低检出菌数为3×102cfu。特异性试验结果显示,该方法对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌以及类志贺邻单胞菌扩增结果均为阴性。应用该方法对37份临床病料样品的检测结果与传统细菌分离鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于A.schubertii的快速检测和流行病学研究。

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究

为建立一种快速、便捷的单增李斯特菌检测方法,本研究针对单增李斯特菌hlyA基因设计了4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的探针,采用环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸条检测技术(LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的单增李斯特菌LAMP-LFD检测方法。通过对其反应条件进行优化,结果显示,优化后的扩增温度和时间为63℃反应50 min,完成检测全过程仅需80 min。该方法仅可以特异性地检出单增李斯特菌,而对其它6种常见食源性致病菌的检测均呈阴性。对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.6 cfu/m L,是利用外引物建立的PCR方法的100倍。该方法重复性好。对15份牛奶和15份猪肉的细菌分离鉴定和LAMP-LFD检测表明,二者符合率为100%。研究结果表明,本研究建立的LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测单增李斯特菌,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值。

产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达

利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特菌(LM)的溶血素基因hlyA,获得一条大小约为1600bp的目的片段,将其与pMD18-T载体连接,经酶切、PCR鉴定,命名为pMD18-T-hlyA。测序结果显示所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列同源性为99%。利用含有BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点引物B从pMD18-T-hlyA扩增不含信号肽序列的目的片段B,获得了大小约为1500bp的基因片段,该片段与pET32a表达载体经BamHⅠ/XhoⅠ处理后进行连接,转化BL21受菌体。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后获得阳性pET32a-hlyA表达重组质粒,将重组菌用终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达,结果表明重组菌在诱导2h～3h表达量最高,融合蛋白约占菌体的40%,分子量大小约为80ku;利用LM的阳性血清进行Western blot分析,证实该融合蛋白可以被LM阳性血清所识别,为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ELISA诊断方法提供了条件。

四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌

目的建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法。方法根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlyA)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16SrRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的最佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率。结果该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,最低可检测到约100fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%。结论成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16SrRNA、aerA、ahpA和hlyA基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株。

食品中单核细胞增生性李斯特菌的快速分离鉴定

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌,能引起人畜共患李斯杆菌病。本文采用两种不同的增菌分离方法从散装牛奶和猪肉中共分离得到8株单增李斯特菌。通过革兰氏染色、生化鉴定、PCR扩增hlyA基因、16SrDNA测序、血清分型等一系列实验对可疑菌株进行分析鉴定。综合实验结果和其他单增李斯特菌分离标准,探讨开发了一种快速分离鉴定单增李斯特菌的方法,该方法可在4～5d内完成单增李斯特菌的分离检测过程。

RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究

目的：建立单核细胞增生李斯特活菌快速检测技术，解决PCR带来的假阳性问题。方法：采用以mRNA为基础的RT—PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测，设计引物，扩增，并作了特异性和灵敏度比较。结果：该引物能较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断，而对其它的李斯特菌以及常见食源性致病菌无特异性扩增条带；检测的灵敏度纯菌可达到1×10^4cfu／ml，人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12—16h，可达4．5cfu／ml（g）。结论：可以应用该方法对样品中单核细胞增生李斯特活菌进行检测，能较好地解决PCR检测所带来的假阳性问题。

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。

TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。

基因工程重组蛋白胞外分泌Ⅰ型系统的研究进展

在基因工程领域,重组蛋白表达后定位于胞内或周质间隙,影响了其表达水平与可溶性,进而影响活性,降低了利用效率。分泌表达至胞外培养基则能较好地解决这一难题。利用细菌天然分泌系统作为重组蛋白胞外递送工具已日益成为生物工程及相关领域的常用策略,其中Ⅰ型分泌系统是研究最多、最具应用前景的。本文简要综述典型的大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌系统以及更具优势的新月柄杆菌SLP(RsaA)分泌系统的生化特性、遗传特征及移植利用等方面的研究进展。