脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)直接竞争elisa方法的建立

利用前期制备得到的DON酶标抗原(辣根过氧化物酶标记)以及抗DON抗体,建立检测食品中DON含量的直接竞争ELISA方法。该方法的检测范围1～100ng/mL,灵敏度达0.56ng/mL,半数抑制浓度IC50为10ng/mL;与DON类似物T-2毒素的交叉反应率为12%;玉米淀粉样品回收率在80.2%～91.1%之间,平均批间变异<15%,平均批内变异<3%。

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白（CAP—OVA）免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素（CAP）单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4C9，并以此制备腹水单抗．经间接竞争ELISA（ciELISA）检测，该单抗亚类重链类型是IgG1，轻链为K类型，单抗腹水效价为1：1×10^6，与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0．01％．用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗，建立了CAP直接竞争ELISA（cdELISA）方法．此法检测的线性范围为0．1～100ng·mL^-1，半数抑制浓度（IC50）为5．81ng·L^-1添加回收实验表明所建立的CAPcdELISA方法检测限达到0．1ng·L^-1，对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当．

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-天冬酰胺酶及药代动力学研究

目的 建立大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶的抗体夹心酶联免疫吸附测定法 ,并进行药代动力学研究。方法 应用重组E .coliL 天冬酰胺酶免疫家兔 ,分离IgG ,用DEAE 纤维素柱色谱纯化 ,辣根过氧化物酶标记抗体 ,建立抗体夹心酶联免疫吸附法 ,测定大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶浓度。结果 方法的线性范围为 1～6 4U·L- 1 ,血药浓度与时间的关系符合二房室模型 ,初期和末端的T1 2 分别为 0 5 0～ 0 5 7h和 2 4 5～ 3 0 2h ,AUC与剂量成正比。结论 建立的抗体夹心酶联免疫吸附法在灵敏度、特异性、线性范围、精密度和回收率等方面 ,满足药代动力学研究要求。实验方法和重组E .coliL

草鱼IgM的纯化、标记及检测方法的建立

通过ProteinA亲和层析法分离纯化草鱼血清中的免疫球蛋白IgM,SDS-PAGE检测产物的纯度及分子量,用纯化产物免疫兔制备多克隆抗体,并用辣根过氧化物酶标记此免抗草鱼IgM抗体,用于检测经草鱼出血病病毒广东株(GCRV-GD108)衣壳蛋白VP4及VP5免疫草鱼后产生的抗体水平。结果表明,纯化后的草鱼IgM轻链及重链分子量分别在25 kD和75 kD左右,所制备的草鱼标记抗体可应用于草鱼血清IgM水平的快速检测。建立了标记抗体检测草鱼抗血清的方法,为进一步研究病原体入侵感染机制、草鱼的免疫防御机理和疫苗效果评价等提供便捷的血清学检测方法。

小鼠抗兔IgG单克隆抗体的制备与应用

制备小鼠抗兔IgG的mAb,经标记HRP和FITC后,应用于ELISA、Western blot、免疫组织化学染色试验以及FCM。以正常兔IgG为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过常规B淋巴细胞融合技术,获得两株分泌抗兔IgG mAb的杂交瘤细胞株,间接ELISA腹水效价均达1×10-7,且亚类均为IgG1(κ)。抗体经鉴定、纯化后,以改良的过碘酸钠法标记HRP,本室常规方法标记FITC。FITC标记的2A1 mAb的F/P值为4.1,2F11的F/P值为2.7。HRP标记抗体的效价和工作浓度分别:2A1为1:25600和1:3200,2F11为1:102400和1:25600。在相同工作浓度条件下,ELISA、Western blot的实验结果,HRP标记的2F11 mAb明显优于商品化抗兔pAb,而且,2A1和2F11 mAb经标记后还可用于免疫组化和FCM,显示出很好的应用前景。

荧光法酶免疫分析测定血清中肝癌细胞的研究

采用以辣根过氧化物酶作抗体标记物的双抗体夹心技术，以对羟基苯乙酸作底物测定荧光来检测酶的活性，从而实现对肝细胞的定量检测．其线性范围为１０－８～１０－５ｇ／ｍＬ，检测限为１０－９ｇ／ｍＬ，ＲＳＤ为３．０％，结果与肝癌检测盒所测定的结果吻合较好，具有较高的可靠性和准确度．

4-羟基苯乙烯基吡啶为辣根过氧化物酶底物的酶荧光免疫传感体系测定布氏杆菌抗体

合成了一种新型辣根过氧化物酶(HRP)荧光底物-4-羟基苯乙基吡啶(pHSP),并首次将它运用于酶联荧光免疫传感体系.对pHSP化学性质的研究证实,pHSP在空气中较稳定,对HRP,H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物,如对羟苯乙酸、Amplex Red和佳味醇等.在pH5.8的Britton-Robinson缓冲溶液中,pHSP本身只有极弱的荧光,在HRP-IgG催化下可被H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在300nm的激发光下能发射波长为437nm的强荧光,并且反应体系的荧光增加与HRP量在一定浓度范围内成线性相关.根据此原理,建立了兔布氏杆菌抗体的酶联荧光传感分析新方法.运用制备的传感装置测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为6.3×10-11～1×10-8mol·L-1,抗体检出限为6.3×10-11mol·L-1,相对标准偏差为4.1%(n=11).pHSP的二聚体产物水溶性很低,利用设计的装置较好地解决了传统测定溶液体系方法灵敏度不高的问题.

白藜芦醇作辣根过氧化物酶底物的布氏杆菌抗体酶联免疫传感器研究

一种纯天然产物白藜芦醇用作辣根过氧化物酶（HRP）底物。对其化学性质的研究证实，白藜芦醇在空气中较稳定，对HRP、H2O2的电化学响应性能优于传统HRP底物，对人体无毒害。白藜芦醇在HRP催化下可被H2O2氧化成醌，产物醌在电极上于一376mV处可被还原，其电流的大小与HRP的浓试在一定浓度范围内呈线性相关。将兔布氏杆菌抗原包埋在石墨．石蜡基质中制备了测定兔布氏杆菌抗体的电化学酶联免疫传感器，该传感器测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为3×10^-4～1．65×10^-2g／L；检出限为1×10^-4g／L；RSD为4．6％。本方法制备免疫传感器的电化学性能稳定，抗原活性保持良好。

辣根过氧化物酶标记JWA抗体及其在免疫检测反应中的应用

目的:运用辣根过氧化物酶标记JWA单克隆抗体,并且将标记的抗体应用于ELISA法和western blot等免疫检测反应中。方法:运用高碘酸盐-四氢硼化钠氧化还原体系活化辣根过氧化物酶,活化的辣根过氧化物酶按1∶1标记JWA单克隆抗体;将HRP标记的抗体分别运用直接和双夹心ELISA测试;同时将标记单克隆抗体运用于western blot检测。结果:辣根过氧化物酶成功标记JWA单克隆抗体。其中HRP-JWA(4C9)抗体在直接法ELISA试验中和多肽的结合能力高于HRP-JWA(7C3);其在450 nm处的最大吸光度值为0.96。双夹心ELISA实验中,预先包被JWA(4C9)单抗,检测抗体使用HRP-JWA(7C3)可以得到较好的实验结果,在450nm处的最大吸光度值为1.30。在western blot实验HRP-JWA抗体浓度1.0μg·m L-1可以检测出SGC7901细胞中目的蛋白。结论:运用氧化还原方法成功标记JWA单克隆抗体,并可以初步应用于免疫反应的检测。

抗HRP单克隆抗体及PAP复合物活性影响因素的研究

作者制备了大鼠抗辣根过氧化物酶单克隆抗体及其与辣根过氧化物酶的复合物,观察了温度(室温、4℃、-20℃、-70℃)、pH值(pH=3,pH=11),蛋白稳定剂(1％BSA,50％中性甘油)及保存时间对抗体活性的影响。以ELISA法及微孔免疫细胞化学法检测抗体活性。结果表明;含此抗体的腹水及培养上清在室温中放置2周,4℃、-20℃、-70℃中放置10个月,抗体活性未见明显改变,加与不加蛋白稳定剂无明显差异。此培养上清在酸性环境(pH=3)中24h,活性严重受损,而其中含1％BSA及腹水者可耐受24h,活性无明显变化。此抗体与酶的复合物在4℃、-20℃、-70℃保存1年,仍保持良好的染色效果,与开始相比无显著性差异。

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-门冬酰胺酶研究

用重组E.coliL门冬酰胺酶免疫家兔,DEAE纤维素柱层析纯化IgG,采用二步戊二醛交联法将辣根过氧化物酶标记抗体,建立抗体夹心酶联免疫吸附法,测定大鼠血浆中重组E.coliL门冬酰胺酶浓度。本测定方法的线性范围为1～64U/L,灵敏度为0.4U/L。建立的抗体夹心酶联免疫吸附法测定大鼠血浆中重组E.coliL门冬酰胺酶具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性。

单克隆鼠PAP制备及其有关特性的研究

采用自制抗辣根过氧化酶单克隆抗体(抗HRP McAb)进行了鼠单克隆PAP(PAPm)研制。并对其染色特性进行观察。以抗HRP McAb AP_4制备PAPm、酶与抗体克分子比值以1:3为佳;腹水与上清制备的PAPm免疫组化染色效果相似,ELISA显色前者低于后者;用于肝组织HBsAg定位检测,本室AP_4、AP_2、AP_5三种抗HRP腹水制备PAPm的染色效价,显色强度及本底显色相当,均接近或达到Sigma公司同类制品的效果。为采用McAb进行临床免疫组化研究提供了可靠的试剂保证。

斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA)检测猪衣原体抗体方法的建立

本研究建立了斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA),对猪衣原体IgG的最小检测量为1.21 ng。以间接血凝试验方法为对照,两种方法同时检测120头份猪血清样品,Dot-PPA-ELISA检出43头份(35.83%),效价≥256;间接血凝试验检出26头份(21.67%),效价≥64。诊断膜片与猪瘟、猪布氏杆菌病、猪口蹄疫和猪弓形体病标准阳性血清均不出现有意义的交叉反应。诊断膜片置室温、4℃和-20℃下至少保存3个月其抗原效价不变。试验表明本方法重复符合率为94.44%,且反应效果不受反应板质量和新旧的影响;试剂用量节省,各步骤均可做到严格定量,操作简便,3 h内可出结果,肉眼即可判断,不需要特殊检测仪器。由于辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(PPA)是一种广谱诊断试剂,因此Dot-PPA-ELISA还可以用于其它哺乳动物衣原体抗体的检测。

初步探求酶标记抗体的合适比例

目的探求酶标记抗体时的最佳比例,以用于体外诊断的实践。方法辣根酶与CEA抗体按照质量比10∶1~1∶10进行连接,着重考察各酶结合物的样品检测情况和在洗涤过程中游离酶的干扰规律,最终找出了酶标记抗体的适宜趋势。结果当抗体与辣根酶的质量比达到5到10倍时,计数高于S0的样品的个数最多,实现了通过标准曲线方程反算出浓度的理想状态。结论在标记抗体的过程中,只需五分之一甚至十分之一的酶量已能够满足需求,过多反而会增加干扰的风险。

基于聚吡咯修饰膨胀石墨电极的甲胎蛋白电化学免疫传感器

构建了测定人血清中甲胎蛋白(AFP)的电化学免疫传感器。此免疫传感器的制备采用恒电位法在膨胀石墨(EG)电极表面合成聚吡咯(PPy),再以戊二醛(GA)作为交联剂,固定辣根过氧化酶标记的AFP抗体(HRP-anti-AFP)。此免疫传感器在含AFP的溶液中于35℃温育50 min后,再在传感器表面修饰普鲁士蓝(PB)作为电子介体,抗原抗体免疫结合产生的免疫复合物会导致HRP对PB催化氧化的效率降低。在优化条件下,AFP的浓度在0.01～300μg/L范围内呈线性关系,检出限为6.25 pg/mL(S/N=3)。这种基于PPy修饰EG电极的免疫传感器制备简单,灵敏度高且价格低廉,有望成为一次性电化学免疫传感器。

辣根过氧化物酶标记兔抗丝状噬菌体衣壳蛋白抗体的制备与初步应用

为了制备用于噬菌体展示肽库的筛选及鉴定等环节的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗丝状噬菌体(M13)衣壳蛋白抗体,试验制备了兔源的M13KE多克隆抗体,将多克隆抗体经饱和硫酸铵法和Protein G Resin层析柱纯化后运用过碘酸钠法对其进行辣根过氧化物酶标记,对标记前和标记后纯化产物进行活性测定,同时对标记后产物进行Western-blot鉴定,以及将其应用到验证已知的阳性噬菌体H11、H12、H14、H16、H18中。结果表明:兔抗M13KE多克隆抗体效价高于1∶32 000,标记后活性高于1∶4 000,标记抗体与已知阳性噬菌体的ELISA鉴定结果与前期测序结果一致。说明此酶标抗体有一定的应用价值。

过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(PAP)检测血清抗核抗体

目的 探讨过氧化物酶 -抗过氧化物酶复合物 (PAP)检测血清抗核抗体 (ANA)的实用性。方法 以小鼠肝细胞为基质 ,对 PAP方法测定血清 ANA的滴度、核型进行了方法学检测 ,并同时与间接免疫荧光法相比较 ,测定了 2 0 3例正常人及 46例风湿病患者的血清 ANA。结果 PAP法敏感性高于 IIF法 ,滴度是 IIF法的 1 0～ 6 4 0倍。PAP可提高血清 ANA的阳性检出率 ,还可提高核型的清晰度。结论 PAP法适用于缺乏荧光显微镜的基层医院开展 ANA的检测。

碳纳米管组装电化学免疫传感器测定IgG抗体的研究

应用吸附法将IgG抗原固定于多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面,制备用于IgG抗体检测的电化学免疫传感器。以辣根过氧化物酶为标记物,对苯二酚为底物,利用辣根过氧化物酶标记IgG抗体与待测IgG抗体竞争电极表面固定的IgG抗原,建立了免疫竞争法检测IgG抗体的高灵敏度电化学分析方法。碳纳米管的大比表面积和电化学催化作用,提高了分子识别物质的固定量和电化学检测的灵敏度。工作电位为＋0.030 V（vs.SCE）时,响应电流与IgG抗体浓度在0.30-10μg/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.11μg/mL。

胃泌素释放肽前体双抗体夹心酶联免疫吸附法的建立及其应用

目的胃泌素释放肽前体(pro-gastrin releasing peptide,PGRP)作为小细胞肺癌肿瘤标志物的应用价值已成为近年来的研究热点,文中建立新型双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)方法检测患者血清PGRP抗原浓度。方法通过人工合成PGRP抗原决定簇对本实验室自行研制的单克隆抗体进行筛选;采用改良过碘酸钠法对筛选到的单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,建立PGRP双抗体夹心酶联免疫吸附检测法;并与IBL公司PGRP试剂盒对比检测结果。结果新型ELISA检测标准抗原浓度范围为33~1.7×104pg/m L,检测小细胞肺癌患者血清PGRP浓度灵敏度100%,特异度98.4%,IBL试剂盒检测灵敏度100%,特异度92.2%。结论新型ELISA方法可用于小细胞肺癌患者血清PGRP浓度检测。

脱氧雪腐镰刀烯醇（呕吐毒素）酶标抗原的合成及免疫抗体的制备

利用琥珀酸酐法合成了脱氧雪腐镰刀烯醇-琥珀酸酐衍生物(3-HS-DON),并用DCC法将该衍生物与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的结合物(DON-HS-BSA)作为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得效价为1∶10000的特异性抗脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)的抗体。同时,用EDC法将3-HS-DON与辣根过氧化物酶(HRP)偶联得到酶标抗原(DON-HS-HRP)。通过圆二色光谱(CD)看到偶联后蛋白二级结构发生了改变,酶活稍有下降;用分光光度法测得酶标抗原酶活损失<5%,偶联物中DON与HRP的结合比为5.29。说明:该酶偶联物及制备的抗体可作为酶联免疫吸附法(ELISA)或免疫传感器法测试脱氧雪腐镰刀烯醇时所需的酶标抗原及抗体。