HRP标记DNA探针的制备及杂交条件探讨

目的 :用辣根过氧化物酶 (HRP)直接标记DNA探针 ,并对其斑点杂交条件进行探讨。方法 :以对苯醌 (PBQ)氧化HRP使其产生活化位点 ,并与聚乙烯亚胺PEI缩合形成HRP -PBQ -PEI复合物 ,再以戊二醛连接DNA ,共价结合构建直接酶标探针进行斑点杂交 ,利用HRP可与底物发生颜色反应的特点观察结果 ,并对不同杂交条件进行研究。结果 :成功构建了HRP标记的DNA探针 ,并进行了斑点杂交反应 ,归纳出较好的杂交条件。结论 :直接酶标DNA探针有较高的特异性及敏感性 ,操作简便快速 。

新型“三明治”结构DNA电化学传感器对急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的检测

基于急性早幼粒细胞白血病（APL）中PML／RARa融合基因的碱基序列，设计了新型的锁核酸（LNA）修饰寡核苷酸作为捕获探针和信号探针，研究出一种基于“三明治”传感模式的电化学生物传感器对PML／RARa融合相关基因进行检测。靶序列分别与捕获探针和信号探针杂交后形成“三明治”结构。将修饰电极置于含有底物3，3’，5，5＇-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢的测定溶液中，用计时电流法检测靶序列。结果表明，该传感器可定量识别和检测溶液中人工合成的短链APLPML／RARa融合基因片段。经过条件优化，杂交前后电流值与靶标链浓度在1．0×10^-12 -2．5×10^-11mol／L范围内呈良好的线性关系，检出限为8．5×10^-13mol／L。该方法简单、特异性好，有望用于实际样品的检测。

HRP直接标记属特异性基因探针检测沙门氏菌的研究

以活化辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ—ＰＢＱ—ＰＥＩ＋—ＮＨ３＋）直接标记沙门氏菌属特异性ＤＮＡ探针ｐＬＳ２和ｐＬＳ３，探针与靶ＤＮＡ杂交后催化发光底物，经增强型化学发光反应（ＥＣＬ），用普通Ｘ光胶片自显影（ＣＰＤ）检测沙门氏菌。经狭缝杂交（Ｓｌｏｔｂｌｏｔ），该法标记探针均可检测到０．１ｐｇ的纯质粒ＤＮＡ及１０３个未经培养的鼠伤寒沙门氏菌。Ｄｏｔ—ｂｌｏｔ杂交结果证明，ＨＲＰ标记的探针仅与沙门氏菌属细菌杂交，而与试验的其他肠道非沙门氏菌不杂交。本研究表明，ＨＲＰ直接标记基因探针化学发光自显影法检测沙门氏菌，安全、快速、简便，且有高度的敏感性和特异性，是一种有较大应用前景的非放射性标记探针杂交检测方法。

多聚酶链反应鉴别致病性与非致病性的溶组织内阿米巴虫株

多聚酶链反应是体外DNA增殖的新技术。在多聚酶、dNTP和引物的参与下在数小时内使特异性的DNA顺序大量增殖。用B、C、G、T4株溶组织内阿米巴的DNA增殖30周期后,作凝胶电泳分析,发现致病性虫株的引物不能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳不出现条带;而非致病性虫株的引物能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳出现特异性条带。用辣根过氧化物酶标记致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA进行斑点杂交呈阴性反应;而用非致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA斑点杂交呈阳性反应。实验结果显示B、C、G、T为非致病性虫株,与同工酶分析一致。多聚酶链反应是鉴别致病性和非致病性溶组织内阿米巴虫株的高特异性和敏感性方法,为从分子生物学研究溶组织内阿米巴的致病机理提供一新技术。