自制显示系统检测免疫印迹中的目的蛋白

目前蛋白免疫印迹显示系统有显色法和化学发光法，因化学发光法具有灵敏、快速、准确等特点而倍受科研工作者的青睐，但一般商品化的化学发光试剂盒价格颇为昂贵，为此，在参考文献的基础上作了一些改进，将Tris-CI的pH值从7．5提高到11．0，同时提高了对碘苯酚的浓度（从1mmol／L提高到2mmol／L），得到了自制的化学发光试剂。首先用其检测了大肠杆茵中表达的2种不同分子量的蛋白（gam，13kDa；bet，30kDa），发现当蛋白上样量为2～20ng时，各蛋白条带均清晰显示。随后的斑点免疫印迹实验表明：自制及进口化学发光试剂在检测酶标二抗效价方面有着同样高的敏感性。

肠道通透性试验及其临床意义

肠道对大分子物质的通透性试验是评估肠道粘膜屏障功能的方法之一.肠粘膜通透性是指某一特定物质在肠粘膜表面通过非易化扩散方式渗透的能力.肠道对大分子物质的通透性增加,意味着肠道结构有变化,肠道内的细菌或毒素有可能通过肠道屏障进入血循环,引起败血症或毒血症.自从20世纪70年代引入非代谢性寡糖类物质作为肠道通透性试验的示踪物以来,检测肠道粘膜屏障功能的肠道通透性试验已广泛应用于临床.

用重组HBsAg和HRP-SPA检测抗-HBs的研究

用高度纯化的哺乳动物细胞分泌的重组HBsAg和HRP-SPA检测血清抗-HBs,其特异性和敏感性与国产抗-HBs RIA药盒相似。用本法和RIA法平行检测71例血清标本,两者符合率达98.6％。认为用重组HBsAg和HRP-SPA检测抗-HBs是一种简单实用的方法。

斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA)检测猪衣原体抗体方法的建立

本研究建立了斑点酶联A蛋白免疫吸附试验(Dot-PPA-ELISA),对猪衣原体IgG的最小检测量为1.21 ng。以间接血凝试验方法为对照,两种方法同时检测120头份猪血清样品,Dot-PPA-ELISA检出43头份(35.83%),效价≥256;间接血凝试验检出26头份(21.67%),效价≥64。诊断膜片与猪瘟、猪布氏杆菌病、猪口蹄疫和猪弓形体病标准阳性血清均不出现有意义的交叉反应。诊断膜片置室温、4℃和-20℃下至少保存3个月其抗原效价不变。试验表明本方法重复符合率为94.44%,且反应效果不受反应板质量和新旧的影响;试剂用量节省,各步骤均可做到严格定量,操作简便,3 h内可出结果,肉眼即可判断,不需要特殊检测仪器。由于辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(PPA)是一种广谱诊断试剂,因此Dot-PPA-ELISA还可以用于其它哺乳动物衣原体抗体的检测。

汉坦病毒核蛋白及其单抗标记物在建立ELISA试剂中的应用

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂。[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记,在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺-过氧化氢(TMB/H2O2)酶底物系统,从血清中检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体,并与免疫荧光抗体法(IFA)进行比较。[结论]检测42份可疑HFRS病人血清,ELISA法和IFA法均阳性的20份,均阴性的19份;ELISA法阴性、IFA法阳性的1份,ELISA法阳性I、FA法阴性的2份,2种方法的差异无统计学意义(配对χ2=0.08,P>0.05)。[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂可用于HFRS的早期IgM抗体检测。

辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展

针对化学法整理纤维材料存在能耗高、纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工。介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP/H2O2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉、黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性。指出HRP在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景。

两种纳米金标记p53抗体探针的制备、表征和性质研究

目的制备IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP两种纳米金标记p53抗体探针,并对其进行生物学特征表征和性质研究。方法利用纳米金粒子与蛋白质非共价吸附和与巯基修饰的寡核苷酸以Au-S键共价结合的特点,将辣根过氧化物酶(HRP)直接或通过寡核苷酸链间接标记在纳米金表面,制备两种多功能纳米金生物探针(IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探针);应用透射电镜、紫外-可见光光谱等对纳米金探针性能进行表征,对纳米金探针表面HRP酶活性进行分析,并通过酶免疫标记技术(enzyme linked immuncsorbent assay,ELISA)优化探针制备条件和比较两种探针标记效率。结果①两种新型探针具有良好的单分散性,大小均一,粒径约10nm;②p53蛋白检测效果对IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探针制备条件优化结果表明:制备IgG-Au-HRP探针时,HRP分子和p53抗体的最佳比例为10:1;制备IgG-Au-DNA-HRP探针时,DNA和p53抗体的最佳比例为2.5:1;③HRP分子定量检测显示:一个IgG-Au-HRP探针可标记HRP数量约11个,IgG-Au-DNA-HRP探针可标记HRP数量为20个;④两种探针结合ELISA法初步检测p53蛋白判定IgG-Au-DNA-HRP探针比IgG-Au-HRP探针检测蛋白灵敏度高。结论两种新型纳米金探针制备简单,可作为一种新型探针应用于微量蛋白的高灵敏检测。

交联大豆分离蛋白的制备及流变学性质

利用二元酶系(辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)和葡萄糖,通过一步法或两步法对大豆分离蛋白进行交联处理。以修饰产物中相对二酪氨酸含量为指标,采用单因素实验确定一步法处理大豆分离蛋白的反应的适宜条件为:葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4.0U/g蛋白质、辣根过氧化物酶添加量200U/g蛋白质、反应时间3h。在一步法处理的反应条件下,一步法和二步法处理的大豆分离蛋白相对二酪氨酸含量分别为414和381。与大豆分离蛋白相比,交联蛋白分散液的表观黏度和黏弹性均有显著改变,同时其酸凝胶的胶凝时间缩短、胶凝温度降低。

HRP标记的二抗检测heme结合蛋白造成假阳性问题的探讨

为了验证对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作为二抗标记物在检测heme结合蛋白时产生假阳性问题的推测,以菠菜细胞色素b6f复合体(Cyt b6f)和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)为检测对象(前者含有heme结合蛋白Cyt f,后者不含heme基团),采用菠菜FNR一抗、HRP和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记的二抗,设计对比实验。结果表明,在使用HRP标记的二抗体系中,Cyt f不经一抗和二抗孵育即可显色,这是明显的假阳性;而在ALP标记的二抗体系中,Cyt f条带不显色,只有FNR条带显色。在western blot实验中,如果被检测蛋白为heme结合蛋白或者混有少量heme结合蛋白,应避免采用HRP标记的二抗,建议使用ALP标记的二抗或者其他二抗产品;heme结合蛋白具有类似HRP的氧化还原酶活性,其本身可以和显色液反应,从而产生假阳性,干扰对实验结果的判断。

辣根过氧化物酶标葡萄球A蛋白组化法快速诊断流行性出血热

本文报告辣报过氧化物酶标葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA) 间接组化法检测EHF特异性IgG抗体,并与IFA法进行了比较。结果表明HRP—SPA组化法和IFA一样,具有相同的特异性而且敏感性更高,其血清抗体滴度为IFA法2～4倍。

用于小鼠及兔源IgG的通用型二抗PA/G-HRP融合蛋白的真核表达及活性检测

目的制备可与小鼠及兔来源IgG结合的通用型二抗,并用于多种免疫检测实验。方法全基因合成金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)、链球菌蛋白G(SPG)与辣根过氧化物酶(HRP)融合基因片段,定向克隆至真核表达载体pcDNATM3.1骨架中,瞬时转染入人胚肾HEK293F细胞进行表达。通过SDS-PAGE、Western blot法鉴定融合蛋白表达情况,通过Western blot法、ELISA、免疫组织化学实验验证其应用。结果酶切鉴定和基因测序显示pPA-HRP、pPG-HRP和pPA/G-HRP表达质粒构建成功。考马斯亮蓝染色和Western blot法结果表明,融合蛋白PA-HRP、PG-HRP和PA/G-HRP在HEK293F细胞中成功表达。Western blot法、ELISA和免疫组织化学结果显示,三种融合蛋白均能识别结合小鼠及兔来源的IgG,其中PA/G-HRP表现出更为灵敏的结合活性。结论成功制备了具有高亲和力、通用型二抗功能的融合蛋白,PA/G-HRP能够替代传统抗小鼠IgG及抗兔IgG,可用于多种免疫检测实验。

APP／PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠视网膜神经节细胞丢失的初步观察

目的研究APP／PS1双转基因阿尔茨海默病（AD）模型小鼠视网膜神经节细胞数目的变化。方法实验研究。选取11个月龄APP／PS1双转基因AD模型雌性小鼠10只作为模型组，同月龄同背景非转基因雌性小鼠10只作为正常对照组。两组小鼠经双侧上丘注射30％辣根过氧化物酶（HRP）逆行标记视网膜神经节细胞。小鼠存活48h后灌注处死，取小鼠大脑做冰冻切片，刚果红染色。取小鼠右眼视网膜并铺片，行视网膜HRP组织化学反应，计算机图像分析系统对视网膜神经节细胞进行计数。取小鼠左眼球做石蜡切片，HE染色，行视网膜各层神经细胞计数。对照组和模型组各层细胞数目的比较采用独立样本t检验。结果模型组小鼠大脑刚果红染色阳性，对照组小鼠大脑刚果红染色阴性。视网膜铺片检测结果显示，对照组与模型组视网膜神经节细胞计数分别为（112．78±7．70）和（78．72±11．35）个／视野，模型组视网膜神经节细胞明显减少（t=27．28，P〈0．01）。石蜡切片检测结果显示，与对照组相比，模型组视网膜内核层与外核层细胞数无明显减少（P〉0．05）；对照组与模型组视网膜神经节细胞层细胞数分别为（8．17±1．17）和（5．17±0．75）个／视野，模型组视网膜神经节细胞层细胞数量较正常小鼠明显减少（t=52．88，P〈0．01）。结论11个月龄APP／PS1双转基因AD模型小鼠视网膜神经节细胞数目减少。

人胰岛素scFv和HRP重组融合蛋白的设计、克隆与表达

传统的酶联免疫分析包括两次分子杂交,在临床检测等实际应用过程中耗时较长,增加了操作人员的劳动强度。通过基因工程构建一抗(单克隆抗体)和标记酶如辣根过氧化物酶(HRP)的融合蛋白,变两次分子杂交为一次分子杂交,即可大大缩短酶联免疫分析的时长。本研究以人胰岛素单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)基因为模板,依据酵母密码子偏好性进行密码子优化、稀有密码子剔除、转录终止子类似结构消除等设计,合成了编码scFv-HRP重组融合蛋白的基因。该基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pET28a与酵母遗传转化载体pGAPZαA。pET-scFv-HRP在E.coli BL21(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),其产率可达总蛋白的4.6%;在E.coli Rosette(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),未出现可见的诱导表达蛋白带。pGAP-scFv-HRP线性化后转化P.pastoris GS115,获得了12个阳性菌落。其中3株(4号,7号和8号)含有较高重组基因拷贝(依据博来霉素测试)。4号转基因酵母菌株摇瓶发酵后,对发酵液和细胞破碎后的上清液进行SDS-PAGE分析,在scFv-HRP理论分子量(63 kD)条带附近有明显的蛋白质条带出现。以抗纯化标签(6×His)抗体进行免疫印迹检测,该位置蛋白条带显示阳性。切下该位置蛋白条带后进一步进行串联质谱分析,结果表明该位置的蛋白条带含有重组蛋白scFv-HRP的片段且氨基酸残基序列一致。重组人胰岛素单链抗体和辣根过氧化物酶融合蛋白scFv-HRP的构建为后续建立胰岛素快速检测方法提供了重要材料基础。