肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

人肽抗生素hPABβ重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人肽抗生素hPAB β重组质粒 ,并在大肠杆菌中进行表达 ,为大量制备hPAB β奠定基础。方法 通过PCR将hPAB β融合蛋白的CNBr裂解位点改为羟胺裂解 ,将修改的目标片段克隆到pFAST HTa质粒中 ,挑取阳性重组子 ,酶切出目标片段再亚克隆到pQE32 CP中 ,含阳性重组子的工程菌用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳分析 ,进一步以亲和层析纯化融合蛋白 ,用羟胺裂解分析。结果 构建的pFAST hPAB β重组质粒经酶切可得到约 2 30bp的片段 ,与预期大小相符 ,测序结果表明其序列正确 ;构建的pQE32 CP hPAB β重组表达质粒酶切亦可切出 2 30bp的片段 ,测序结果表明序列和阅读框均正确 ;重组表达质粒在大肠杆菌中能表达出Mr约2 7× 10 3 大小的蛋白 ,表达量约占细菌总蛋白的 4 3% ,该融合蛋白以包涵体形式存在 ,通过亲和层析可获得该蛋白 ,纯度为 80 4 % ,该融合蛋白经羟胺裂解 1h即可得到与合成肽大小相符的小肽。结论 本研究成功构建了含hPAB β重组质粒的工程菌 ,为进一步研究和大量制备hPAB β创造了前提。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。

肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建

目的通过重新构建新的3拷贝串联体基因工程菌phPAB-β(3)/M15,在原有肽抗生素hPAB-β制备工艺路线基础上,使发酵后目的肽的最终产量得到提高。方法重新构建含有重组质粒pQE31-hPAB-β(3)的基因工程菌M15,然后筛选出能够稳定而且高效表达目标蛋白的最佳工程菌株,进行传代稳定性分析,并明确新建工程菌中目标融合蛋白的表达形式和亲和层析的效果,最后通过相同条件下,在逐步放大的发酵规模(1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐),与以往的3拷贝串联体工程菌phPAB-β(3)/JM109进行对比研究(湿菌产量、目标蛋白表达率),同时观察新建工程菌在10L发酵中目标蛋白的表达和遗传稳定性。结果筛选出的最佳工程菌株的目标蛋白的表达效率为34.8%,经LB培养传代10次后,点种LB(AMP、KAN)平板,生长率为100%,质粒保存率达100%。在1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐的发酵规模下,phPAB-β(3)/M15与phPAB-β(3)/JM109一样,目标融合蛋白都以包涵体形式表达,亲和层析效果相近,目标蛋白表达率无显著性差异(P>0·05),但发酵产量大于后者,有非常显著性差异(P<0·01)。且新建工程菌在10L发酵中发酵产量达到55.15g/L,诱导表达后的第5小时,蛋白表达达到高峰,蛋白表达率为30.2%,重组质粒保存率为100%。结论新构建工程菌phPAB-β(3)/M15比起原来基因工程菌phPAB-β(3)/JM109,是更为理想且利于肽抗生素hPAB-β工业生产的基因工程菌。

人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的 :对已构建的人肽抗生素hPAB β 1～ 8拷贝串联基因工程菌进行筛选 ,并对其优势菌株进行发酵研究 ,为hPAB β的规模生产奠定基础。 方法 :对 1～ 8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后 ,选择 2～ 5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较 ,确定最佳多拷贝菌 ;对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。 结果 :在相同条件下 ,3拷贝菌产量(3.15 3g/L)最高 ,目标蛋白表达率 (2 7.8% )接近最高水平 ,包涵体能溶解完全 ;利用亲和层析能成功捕获融合蛋白 ,后者经羟胺裂解 ,可获得相对分子质量与合成hPAB β成熟肽大小相符的小肽 ,筛选出的优势菌传代稳定 ,其最佳摇瓶发酵条件为 37℃ ,16 0r/min条件下 ,在改良M 9 CAA培养液中培养至吸光值 (A60 0 )≈ 2 .5时 ,以终浓度为10 0 μmol/L的IPTG诱导表达 5h。 结论 :确定了 3拷贝菌为最佳多拷贝菌 ,并确定了其最佳摇瓶发酵参数。

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

联合检测血清抗HpAb、胃泌素-17和MG7-Ag对胃癌诊断的临床意义

目的研究联合检测血清抗HpAb、胃泌素-17和MG7-Ag对胃癌诊断的临床意义。方法选取2007年12月至2017年12月来我院普外科就诊的202例患者作为实验组,选取来我院体检中心接受体检的50例健康志愿者作为对照组,所有受试者进行血清抗HpAb、G-17和MG7-Ag检测及染色内镜检查。结果胃癌组抗HpAb水平显著高于对照组和胃良性疾病组(P <0. 05);胃癌组G-17、MG7-Ag水平显著低于对照组和胃良性疾病组(P <0.05);对照组联合检测的阳性检出率显著低于单项血清抗HpAb、G-17和MG7-Ag检测(P <0.05);胃良性疾病患者联合检测的阳性检出率显著高于单项血清抗HpAb、G-17和MG7-Ag检测(P<0.05);胃癌患者联合检测的阳性检出率显著高于单项血清抗HpAb、G-17和MG7-Ag检测(P<0.05);联合检测的灵敏度、特异性和准确性均高于单项血清抗HpAb、G-17、MG7-Ag检测(P<0.05)。结论联合检测血清抗HpAb、胃泌素-17和MG7-Ag对胃癌进行诊断,能够提高胃癌临床诊断的灵敏度、特异性和准确性,对胃癌的早期发现具有重要的临床诊断意义。

西瓜噬酸菌hpaB基因的功能研究

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是西瓜、甜瓜等葫芦科植物上的重要病害,是一种世界范围内重要的检疫性、种传病害,病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是西瓜噬酸菌致病过程中的关键毒力因子,参与调节细胞的多种生理生化反应。hpa(hrp-associated)基因是植物病原细菌Ⅲ型分泌系统hrp基因簇的重要组成部分,T3SS分泌蛋白在分泌过程中通常需要hpa基因编码的蛋白质介导,这些蛋白通常有利于植物病原细菌发挥其致病性。为了探究Ⅲ型分泌系统hpaB基因在西瓜噬酸菌致病过程中的功能,以西瓜噬酸菌Ⅱ型菌株Aac5为研究对象,构建hpaB基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对致病力、致病相关表型以及相关基因表达量进行测定。结果表明:hpaB基因缺失后,对寄主植物西瓜和甜瓜的致病力显著减弱,并丧失了诱导非寄主烟草HR应答能力,运动能力减弱,生物膜形成能力增强。荧光定量结果表明:hpaB基因缺失后,影响T3SS相关基因及其他致病相关基因的表达。研究表明hpaB基因在西瓜噬酸菌致病过程中起到了重要的作用。

煤体高压空气爆破模拟试验研究

高压空气爆破(high-pressure air blasting,HPAB)是通过瞬间释放高压气体冲击煤体达到增加煤体渗透性的一种物理爆破技术,该研究通过自主研发的高压空气爆破试验系统开展模拟煤体高压空气爆破试验,试验过程中对试块的超声波波速、应变和裂纹扩展速度进行测试,基于试验结果和损伤断裂力学理论揭示了煤体高压空气爆破应力波传播与衰减规律和损伤断裂过程与机理。煤体中高压空气爆破应力波和炸药爆炸应力波的波形特征相同,但高压空气爆破应力波峰值小、作用时间长、脉宽长、衰减慢(α=2-μ/(1-μ))。煤体首先在高压空气爆破应力波作用下产生初始径向裂纹,初始径向裂纹以0.15~0.40倍应力波波速扩展。随后,高压气体、瓦斯气体和远场应力共同作用驱动初始裂纹以0.12~0.14倍应力波波速度稳态扩展,最后远区煤体内部的一系列周期性原生裂纹在弹性应力波、原岩应力和瓦斯气体的共同作用下在小范围内缓慢扩展。

两种非侵入性检测方法对儿童幽门螺杆菌感染的诊断价值分析

目的:研究幽门螺杆菌((Helicobacter pylori,Hp)粪便抗原检测(HpSA)及血清抗幽门螺杆菌试验(Hp-IgG)在诊断儿童HP感染中的价值。方法:以胃黏膜快速尿素酶法(RUT)和组织染色法联合检测结果作为Hp感染诊断"金标准",通过对137患儿HpSA及Hp-IgG的检测,并与"金标准"进行对比分析。结果:137例患儿中"金标准"阳性75例,阴性62例,以金标准作为Hp感染的诊断标准,HpSA检测的敏感度92.0%,特异度95.1%,准确性93.4%;Hp-IgG检测的敏感度89.3%,特异度91.9%,准确性90.5%。结论:HpSA检测是较理想的非侵入性诊断儿童Hp感染的方法,值得在临床推广。