野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X anthom onas camp estris pv.camp estris,简称X cc),是一类能在全球范围引起十字花科植物黑腐病的γ-变形菌纲细菌。该菌有一个长41.7 kb的H rp致病岛,包含41个开放阅读框(ORF)。H rp致病岛5′端边界为IS1479插入元件,3′端边界为IS1595插入元件。G+C含量为62.3%,明显低于全基因组64.9%的G+C含量。根据基因类型,将该致病岛分为三个区段:位于致病岛中心区的hrp基因簇、及其左侧翼的假定基因区段(HGR)和右侧翼的降解酶类基因区段(EGR)。HGR长7.4 kb,注释蛋白编码基因6个,全部为功能未知的假定基因。EGR长9.3 kb,注释蛋白编码基因8个,其中6个为降解酶类基因。为了鉴定hrp基因簇侧翼序列的功能,采用标记置换的突变方法,将X cc 8004的hrp基因簇右侧翼EGR片段缺失。该突变体8004ΔR对寄主植物的致病力比野生型菌株显著降低,而在非寄主植物辣椒ECW-10R上仍能引起过敏反应。该突变体其它的致病相关生化因子,如胞外多糖产量和胞外酶的活力均未受明显影响。实验结果表明EGR区段的缺失不影响三型分泌系统的正常功能,也不影响该菌在基本培养基上的生长,但使X cc的致病力明显降低,提示X cc 8004菌株hrp基因簇右侧翼序列中存在与致病相关的基因。

青枯菌hrp基因的研究进展

青枯菌的hrp基因可诱发植物的超敏反应。对其基因组全序列测定表明:hrp基因簇位于基因组的大质粒上,共有20多个基因组成。从青枯菌中分离得到的可直接诱发植物超敏反应的效应蛋白主要为pop基因编码,它由hrp基因编码的类型III蛋白分泌通道释放。目前的研究表明:(1)在hrp基因簇中,hrpY、hrpX及hrpV与分泌通道的一种纤毛的组装有关;(2)hrpB是整个类型III蛋白分泌通道基因的转录激活子并作用于基因组中的其它效应基因;(3)hrpG是植物信号对hrp基因的表达进行级联调控的组分之一。

植物病原细菌hrp基因簇比较基因组分析

hrp基因是植物病原细菌中一类重要的致病基因,一般成簇排列。对14种已完成全基因组测序的植物病原细菌基因组中的hrp基因簇进行了大小、G+C含量、基因组成的BlastP比较。发现它们的大小在18～24 kb,由22～28个基因组成。欧文氏菌属和假单胞菌属的菌株中G+C含量较低,拉尔氏菌属和黄单胞菌属菌株的G+C含量较高。而且,各菌属的基因簇都有其独有的hrp基因,如假单胞菌属是hrpK1、hrpV、hrpA;欧文氏菌属是hrpT、hrpV、hrpA;拉尔氏菌属是hrpZ、hrpX、hrpY、hrpV;黄单胞菌属是hrpE、hrpD6、hpaA。其中,基因hrpA1、hrpA、hrpY和hrpE在假单胞菌属、欧文氏菌属、拉尔氏菌属和黄单胞菌属中均编码Ⅲ型菌毛的基因,可能在寄主和病原物识别中起重要作用。

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

软腐欧氏杆菌的Ⅲ型分泌系统对harpin蛋白的识别与分泌

本文研究软腐欧氏杆菌分泌致病蛋白的Ⅲ型分泌系统的组分是否能识别梨火疫欧氏杆菌存在于mRNA上的分泌识别信号。用PCR的方法 ,将带有上游 75bp可以在其mRNA的5′端形成一个典型的作为Ⅲ型分泌识别信号的茎环结构的梨火疫欧氏杆菌的诱导植物过敏反应的harpin的基因hrpN ,从带有hrp基因簇的质粒pCPP43 0上克隆到pGEM T载体上 ,获得重组质粒pWGF1 ,经化学法转化到hrpN基因的转座突变体DH5α(pCPP43 0hrpN- )中 ,同时将pWGF1电击转化到胡萝卜软腐欧氏杆菌Se9R中 ,转化子的无细胞抽提物 (CFEP)经Western blot检测到harpin蛋白已被表达 ;带有双重质粒的DH5α(pCPP43 0hrpN- pWGF1 )在番茄植物上可以引起过敏反应 ,Se9R(pWGF1 )在大白菜上的致病力明显低于Se9R ,初步表明一种植物病菌的harpin蛋白可被另外一种病菌的Ⅲ型分泌系统所识别。