水稻条斑病细菌hrp调节基因hrpG_(Xooc)和hrpXooc的克隆和序列分析

Xanthomonasoryzaepv.oryzicola基因文库的hrp基因克隆pUHRS138携 39.3 kb大小的hrp基因片段。经系列亚克隆和对hrp 突变体的功能互补验证 ,4 .5 kbBamHI KpnI为最小功能片段 ,该片段可使X .o .pv .oryzicola的hrp 突变体恢复在烟草上激发产生HR和在水稻上具致病性。序列测定和分析显示 ,4 .5 kbhrp片段中含hrpXooc和hrpGXooc基因。单独的hrpGXooc和hrpXooc不能功能互补hrp 突变体。hrpXooc与其它黄单胞菌中已克隆的hrpX的同一性达 83%以上 ,推测的蛋白质水平上的差别主要在32、14 1、16 4、175、2 13、2 4 7和 35 7位点上。HrpX序列中α 螺旋 转 α 螺旋结构在黄单胞菌中高度保守。hrpGXooc与水稻白叶枯病菌的hrpGXoo同一性达 96 % ,与X .campestrispv.vesicatoria的hrpGXcv同一性达 87% ,与Ralstoniasolanacearum的hrpGRs同源性较低 ,4种HrpG蛋白质水平上的差别主要集中在 2 2、2 9、115和 2 5 2位点上。HrpGXooc和HrpGXcv同列比较显示 ,3～ 9和 2 16～ 2 2 0区域的氨基酸序列有所不同 ,可能反映了HrpG蛋白在感知环境信号和调节hrp基因表达方面的差别。

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。

hrp基因关键调控因子HrpG在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究

水稻自叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)在非寄主烟草上产生过敏反应(HR)和在寄主水稻上具有致病性,是由hrp致病岛决定的,其中HrppG为关键调控因子。Xoo和Xoc侵染水稻途径和在水稻上产生病害症状的不同,是否与hrpG基因有关,还不清楚。本研究利用反向遗传学方法获得了Xoo和Xoc的hrpG突变体:P△hrpG和R△hrpG,并用hrpG_(Xoo)基因和hrpG_(Xoc)基因分别互补上述2个突变体,获得了相应的互补菌株。致病性测定结果显示,P△hrpG和R△hrpG突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生HR的能力,而hrpG_(Xoo)基因和hrpG_(Xoc)基因可分别互补上述突变体至野生型水平。利用GUS报告基因检测基因启动子活性发现,hrpG_(Xoo)和hrpG_(Xoc)的启动子活性没有显著差别;RT-PCR和Western杂交结果显示,hrpG基因交叉互补菌株中HrpG调控的下游基因hrpX、hpaR、hrcT、hpa2和hrpD6的表达没有差异,且Ⅲ型分泌系统分泌蛋白Hpa2的分泌性没有受到影响。这些结果表明,稻黄单胞菌hrpG基因可在Xoo和Xoc中交叉互置,位于其上游和下游的调控途径可能相似,而决定Xoo和Xoc在水稻上的侵染途径以及所致病害症状差异可能与hrpG基因位点无关。