hsBAFF对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖与免疫应答及胞内Ca^(2+)水平的影响

目的:探讨大肠杆菌表达的人源可溶性B淋巴细胞激活因子hsBAFF对小鼠脾脏B淋巴细胞免疫反应及其对胞内游离Ca2+信号变化的影响。方法:选择20只健康ICR小鼠,雌雄各半,随机分成两组(n=10):①对照组;②hsBAFF实验组。实验组小鼠腹腔注射含hsBAFF(0.1mg/kgbw)的PBS溶液,对照组注射同等剂量的PBS溶液,连续8d。用MTT法检测小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖及其对LPS刺激的免疫反应,并用激光共聚焦显微镜分析脾脏B淋巴细胞胞内钙离子水平([Ca2+]i)变化。结果:hsBAFF注射小鼠的脾脏B淋巴细胞增殖和对LPS刺激的免疫反应均明显高于对照组(P<0.05);hsBAFF注射组[Ca2+]i荧光强度维持在相对稳定的高水平上波动,平均荧光强度显著高于对照组(P<0.01),且荧光强度变化率小于对照组。结论:大肠杆菌表达的hsBAFF能促进B淋巴细胞的增殖和免疫应答,从而增强机体免疫功能。hsBAFF激活小鼠脾脏B淋巴细胞可能与[Ca2+]i升高有关。

抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞因子hsBAFF在大肠杆菌中的融合表达

为进一步探讨抗菌肽CM4的原核表达及其生物学功能,研究了抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞刺激因子hsBAFF的融合表达及抗菌肽CM4的生物学活性。运用PCR把B淋巴细胞因子hsBAFF和家蚕抗菌肽CM4进行基因融合,构建了融合表达载体pET28a(+)/CM4-hsBAFF,并在大肠杆菌中获得高可溶性表达的融合靶蛋白,且存在于超声破碎后的上清,经分子筛Sephadex G-75纯化后的重组融合蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.SDS-PAGE分析表明:可以通过分子筛一步纯化得到融合蛋白,该重组融合蛋白的分子量约22.0kDa。Western blot结果显示该重组蛋白能与鼠抗人hsBAFF的抗体发生特异性反应.运用基因工程的方法获得CM4-hsBAFF重组融合蛋白,并具有很好的抑菌生物学活性。

hsBAFF通过钙信号转导激活mTOR通路调节B淋巴细胞增殖研究

本研究运用细胞培养、流式细胞仪、Western bloting等细胞学分子生物学技术,选用胞内钙离子鳌合剂BAPTA/AM、胞外钙离子鳌合剂EGTA、内质网IP3R抑制剂2-ABP、CaMKII特异性抑制剂KN93以及mTOR特异性抑制剂雷帕霉素,综合研究和观察了hsBAFF刺激B淋巴细胞增殖与升高的[Ca2+]i的关系。

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a(+)扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a(+)中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为5h,温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.