提高重组毕赤酵母表达hIFNβ-HSA的碳源控制策略

研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNβ-HSA)表达的影响.结果表明,在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低,进而减少hIFNβ-HSA的表达量.在此基础上,提出了菌体培养后期,即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略,不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的不利影响,而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%),从而可以提高甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的水平,表达量可达37.3mg/L,最大生产强度为0.78mg/(L-h),较对照分别提高了92.3%和44.4%

人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达

目的:构建人源单克隆抗-HBs Fab-IFN-α表达载体,探讨该融合蛋白原核表达的可行性及其生物学活性。方法:用PCR体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBs Fab基因的载体,插入点位于轻链基因3′未端。利用酶切、PCR鉴定筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠杆菌,挑选单克隆表达、纯化目的蛋自,用ELISA 方法检测融合蛋白IFN-α的抗原性及其抗体亲和性,用WISH细胞检测IFN-α生物学活性。结果:利用插入了人源抗-HBs Fab基因及IFN-α基因的pBAD／gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的λ轻链与IFN-α的融合蛋白,其既具有与抗-HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素的活性。结论:λ轻链与IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达某些特异抗体和其介导的部分生物活性因子,是一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了线索。

提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达:人干扰素毕赤酵母表达体系研究

以毕赤酵母KM71/IH的hIFNβ-HAS表达体系为研究对象,较为系统地研究了不同因素引起的细胞相对活性变化与毕赤酵母外源蛋白表达的相关性。结果表明:(1)细胞相对活性变化与外源蛋白的表达成正相关;(2)处在对数生长中后期的细胞相对活性最高,更适合用于外源蛋白的表达;(3)诱导阶段的环境因素直接影响诱导期细胞相对活性,合适的甲醇浓度、诱导pH及温度是维持细胞高活性,促进外源蛋白高表达的关键。对于hIFNβ-HAS表达体系最佳诱导条件为:以培养21～24h的细胞为诱导种子,初始甲醇浓度为2%(V/V),pH6.0,25℃,细胞活性维持在98%以上,hIFNβ-HSA表达量高达45.6mg/L,较优化前提高了62.3%。

人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制

筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白。经摇瓶及5 L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件。经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L。离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化。纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测。筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件。纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95%,相对分子质量为85 821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符。内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求。体外生物细胞活性高达1.6×106IU/mg。具有良好的工业应用价值。

人γ-干扰素研究进展

本文不仅综述了人γ-干扰素(hIFN-γ)分子结构的多态性,而且简介了表达载体的构建、表达和表达产物的纯化等技术方法,并对现存的问题和前景作了简要分析。

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。