人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人ＬＩＧＨＴ基因，构建其重组腺病毒载体，以研究ＬＩＧＨＴ过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法用ＲＴ－ＰＣＲ法从人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中克隆人的ＬＩＧＨＴ全长基因。将ＬＩＧＨＴ ｃＤＮＡ克隆到穿棱载体ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ和骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ－１，以电穿孔法共转染大肠杆菌ＢＪ５１８３，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染２９３细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ＬＩＧＨＴ基因的表达。 结果 用ＲＴ－ＰＣＲ法从人的ＰＢＭＣ中，扩增出７２３ ｂｐ的ｃＤＮＡ，测序证实为人ＬＩＧＨＴ基因。荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，ＬＩＧＨＴ重组腺病毒可感染２９３细胞，并在２９３细胞内进行有效的复制。结论成功地克隆了人ＬＩＧＨＴ基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究ＬＩＧＨＴ基因的功能提供了条件。

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的:克隆人LIGHT胞外区基因(hsLIGHT),构建其原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT,将其克隆入原核表达质粒pGEX-4T-2,构建其重组表达质粒pGEX-4T- 2/hsLIGHT,以不同浓度IPTG诱导表达,于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果:经RT-PCR扩增获得的 hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致;SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47 000的蛋白,与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论:成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建,在大肠杆菌E．coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT,为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中LIGHT及其受体基因表达的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞16HBE中肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)及其受体LTβR和HVEM基因表达的影响。方法将体外培养的16HBE细胞分为干预组和对照组,干预组分别加1%、2%、3%、4%、5%CSE培养48 h,或以3%CSE分别培养6、12、24、36、48 h;对照组加同样体积的无血清DMEM处理。收集对照组和干预组不同浓度和不同作用时点的细胞,采用real-time PCR法检测LIGHT、LTβR、HVEM mRNA。结果与对照组比较,干预组CSE作用16HBE细胞48 h后LIGHT LTβR mRNA表达升高,分别于3%~5%、2%~5%CSE时差异有统计学意义(P均<0.05);干预组1%~4%CSE作用16HBE细胞48 h后HVEM mRNA表达升高(P均<0.05),3%CSE时到达峰值,5%CSE时HVEM mRNA表达较对照组降低(P<0.05)。与对照组比较,3%CSE作用16HBE细胞后各时点LIGHT、LTβR mRNA表达逐渐升高,分别于36、48 h和24、36、48 h时差异有统计学意义(P均<0.05);3%CSE作用16HBE细胞48 h时HVEM mRNA表达升高(P<0.01),其余时点表达变化不显著。结论随着CSE浓度升高和作用时间延长,可引起16HBE细胞LIGHT、LTβR、HVEM基因表达的改变。

鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析

从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 。

基于光纤式动态光散射的人血清白蛋白研究

人体尿液中血清白蛋白急剧增加会导致肾脏病发生几率增大,利用动态光散射技术(dynamic light scattering,DLS)研究人血清白蛋白有助于推动诊断肾脏病的早期发现。分析了人血清白蛋白的物理模型;利用单模光纤搭建了动态光散射实验系统,并配制了实验所需的人血清白蛋白水溶液;最后使用该系统研究了人血清白蛋白分子的扩散系数在不同蛋白浓度和pH值条件下的扩散系数。实验和分析结果表明库仑力对蛋白质的扩散起主要作用,在等电位点下(pH=5.2)库仑力的影响消失,蛋白质的扩散系数最小;在等电位点测量出扩散系数随浓度的增加而线性减小;在浓度5 mg/mL～40 mg/mL内互扩散系数Dm=D0[1-(0.00194±0.00008)],D0=(6.74±0.01)×10-7cm2/s为外推至零浓度下23℃时蛋白质的扩散系数。这里C为蛋白质浓度,实验测得人血清白蛋白的半径为(3.44±0.01)nm。

小鼠单抗R5基因的克隆和基于CDR相似性的人源化质粒构建

抽提小鼠R5杂交瘤细胞的mRNA,逆转录成cDNA,扩增出R5单抗的轻重链基因.分析克隆到的轻重链基因的序列信息,得到互补决定区(CDR)序列信息.构建真核表达质粒并在真核细胞中表达.采用互补决定区移植(CDR-grafting)的方法人源化鼠源单抗R5基因.先从人种系(germline)抗体基因片段中选出和克隆到的小鼠R5抗体基因具有相同互补决定区正则结构类型(CDR canonical structure class)的片段,合成寡核苷酸并采用PCR重叠延伸(overlap extension)的方法得到人源化的VL和VH,并采用双酶切方法分别克隆入昆虫杆状病毒表达载体pAc-k-CH3中,经测序确定序列正确.大抽后的质粒和线性杆状病毒DNA共转Sf9昆虫细胞,表达得到的抗体用ELISA能检测到和抗原的结合活性.轻重链基因的成功克隆和人源化表达质粒的构建及表达为下一步改善人源化R5单抗的特性打下了基础,并向R5单抗的抗肿瘤临床应用迈进了一步,具有重要的意义.

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的 克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法 从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果 RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论 本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 。

人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析

目的获得人源性乙型肝炎病毒前Ｓ２抗体轻链基因。方法用人工合成的乙型肝炎病毒前Ｓ２短肽（Ｐｒｅ－Ｓ２，１２０—１４５），从已构建的人源性噬菌体抗体库中，得到了针对Ｐｒｅ－Ｓ２阳性克隆，经竞争抑制实验证明其特异性和活性，合成一对轻链引物，经ＰＣＲ扩增，亚克隆入质粒ＰＵＣ１８进行序列测定及分析、结果筛选到的阳性克隆具有乙型肝炎病毒前Ｓ２特异性亲和力。构建了ｐＵＣ１８－ Ｐｒｅ－Ｓ２ｋ。轻链重组质粒，序列分析其为人ｋ轻链，包括了完整的恒定区和可变区，大小为 ６４５ ｂｐ。结论利用抗原抗体特异性反应原理。

5’-RACE法扩增抗人乳头瘤病毒16型L1蛋白单克隆抗体轻链可变区基因及序列分析

目的获得抗人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白单克隆抗体的轻链可变区（VL）基因并分析序列。方法从分泌抗HPVl6L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录形成CD-NA，用5’-RACE策略扩增抗体轻链可变区基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测序及进行序列分析。结果VL基因全长336bp，编码112个氨基酸，基因测序结果符合小鼠抗体轻链可变区特征。结论5’-RACE法成功获得了抗HPV16L1蛋白的单克隆抗体轻链可变区基因的真实序列，为基因工程抗体研究奠定了良好基础。