Apoptosis mechanisms of human gastric cancer cell line MKN-45 infected with human mutant p27

AIM: To explore the inducing effect of human mutant p27 gene on the apoptosis of the human gastric cancer cell line MKN-45 and its associated mechanisms. METHODS: The recombinant adenovirus Ad-p27mt was constructed to infect the human gastric cancer cell line MKN-45. Using flow cytometry, TUNEL assay and DNA fragment analysis, we measured the apoptotic effect of Ad-p27mt on the human gastric cancer cells. RESULTS: Ad-p27mt was successfully constructed and the infection efficiency reached 100%. After 18 h of infection, we observed an apoptotic hypodiploid peak on the flow cytometer before G1-S and apoptotic characteristic bands in the DNA electrophoresis. The apoptotic rate detected by TUNEL method was significantly higher in the Ad-p27mt group (89.4±3.12%)compared to the control group (3.12±0.13%, P ＜ 0.01).CONCLUSION: Human mutant p27 can induce apoptosis of the human gastric cancer cells in vitro.

Anticancer effect of Jinlongshe granules on in situ-transplanted human MKN-45 gastric cancer in nude mice and xenografted sarcoma 180 in Kunming mice and its mechanism

瞄准：到学习，汉语的反肿瘤效果加重 jinlongshe (JLS ) 肉瘤 180 上的小粒和 MKN-45 人的胃的癌症房间线在活体内和它的机制。方法：在 S180 肉瘤(S180 ) 和胃的癌症裸体老鼠建模的 MKN-45 的建立以后，忍受肿瘤的老鼠在随机被划分成 5 个组。三个试验性的组分别地在 120 g， 60 g 和 20 g/ 的剂量被给 JLS 小粒的水浸膏(kg 每 6/wk， i.g ) 为在 S180 的 3 wk 和在裸体的 6 wk，老鼠当模特儿。积极控制在 50 mg/ 的剂量被给出租机动三轮车磷酰胺(Cy )(kg 每 3/wk， i.g ) 为在 S180 模特儿和 5 氟尿嘧啶(5-FU ) 的 3 wk 20 mg/(kg 每 3/wk， i.g ) 为在裸体的 3 wk，鼠标当模特儿。否定控制在 0.18 g/ 的剂量被给生理盐水(NS )(kg 每 6/wk， i.g ) 分别地。在在忍受 S180 肿瘤的老鼠的 3 wk 和在老鼠建模的裸体的 6 wk 以后，实验动物被牺牲，肿瘤的群众被称，并且每个对待的组的肿瘤抑制的率分别地是计算的。为了决定反肿瘤，机制，词法变化，房间周期和 apoptosis 在老鼠建模的 MKN-45 裸体被观察。Annexin V-FITC/PI 两倍染色的 FCM 试金被用来进一步决定实时房间， apoptotic 房间，坏死的房间和碎片。结果：在 20 g/kg， 60 g/kg 和 120 g/kg 的剂量的 JLS 小粒的禁止的率是 50.31% ， 55.94% 和 68.13%(P 【 0.01 ) 在裸体老鼠模特儿并且 40.90% ， 50.32% 和 58.46%(P 【 0.01 ) 在 S180 模特儿。Cy 的禁止的率在 S180 模特儿是 85.22% ， 5-FU 的禁止的率在老鼠建模的裸体是 53.43%(P 【 0.01 ) 。原子染色质和着边在一台传播电子显微镜(TEM ) 下面被观察。G0/G1 阶段被逮捕的、典型 apoptotic 山峰出现了， apoptotic 率是在三个 JLS 对待小粒的组的 22.81%-38.54% 。两倍染色的 FCM 试金显示出的 Annexin V-FITC/PI apoptotic 房间在三剂量是 4.36% ， 3.08% 和 7.08% ，大多数房间在低正确象限是局部性的。结论：Jinlongshe 小粒在试验性的肿瘤模特儿在活体内，和 apoptosis 正式就职上拥有反肿瘤效果是它的反肿瘤机制之一。

MAPK通路在红托竹荪多糖诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡中的作用机制研究

目的:研究红托竹荪多糖对人胃癌MKN-45细胞增殖与凋亡的影响,并基于丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路探讨其可能的作用机制。方法:体外培养MKN-45细胞,分为对照组,红托竹荪多糖低、中及高剂量组,采用终浓度分别为0、4、6及8 mg/mL的红托竹荪多糖作用于细胞48 h后,采用细胞计数法检测红托竹荪多糖对人胃癌MKN-45细胞增殖的影响;采用倒置显微镜观察不同浓度的红托竹荪多糖作用于人胃癌MKN-45细胞48 h后细胞形态学的变化。设立实验组的红托竹荪多糖终浓度为8 mg/mL,采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染色流式细胞技术检测细胞的凋亡率;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用蛋白质印迹法检测红托竹荪多糖作用胃癌细胞后p38蛋白激酶(p38)、磷酸化p38蛋白激酶(p-p38)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、C-JUN氨基末端激酶(JNK)、磷酸化C-JUN氨基末端激酶(p-JNK)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)和活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白的表达,即与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)灰度值比值。结果:作用48 h后,不同浓度的红托竹荪多糖(4、6及8 mg/mL)对人胃癌MKN-45细胞增殖的抑制率分别为(8.27±5.99)%、(21.83±5.77)%和(56.95±5.21)%;在检测的浓度范围下,随着浓度的升高,红托竹荪多糖对MKN-45细胞增殖的抑制率逐渐升高。倒置显微镜下显示,经8 mg/mL的红托竹荪多糖作用48 h后,MKN-45细胞密度与对照组相比明显减少。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,实验组人胃癌MKN-45细胞凋亡率显著升高(P<0.05);细胞周期结果显示,实验组G_(1)期细胞比例明显减少(P<0.05),G_(2)期细胞比例明显增多(P<0.05),S期细胞比例明显减少(P<0.05);蛋白质印迹法结果显示,与对照组相比,实验组MKN-45细胞中cleaved Caspase-3的表达有升高趋势(P<0.05),Bcl-2的表达有降低趋势(P<0.05),p-P38/P38比值、p-ERK/ERK比值与p-JNK/JNK比值均低于对照组(P<0.05),上述差异均有统计学意义。结论:红托竹荪多糖在体外能抑制人胃癌MKN-45细胞增殖并诱导细胞凋亡,使肿瘤细胞阻滞在G_(2)/M期,其作用可能通过调控MAPK信号通路实现。

金龙蛇颗粒对原位移植人MKN-45胃癌组织基因表达谱的影响

目的:利用基因表达谱芯片研究金龙蛇颗粒对MKN-45胃癌的分子机制。方法:抽提经金龙蛇颗粒治疗的裸鼠原位移植人MKN-45胃癌组织和生理盐水阴性对照的瘤组织总RNA并纯化mRNA,分别逆转录并进行荧光标记,制作成cDNA探针,与包含4096个人类基因的cDNA表达谱芯片进行杂交,筛选出两组间差异表达基因。结果:在mRNA水平上,筛选出包括与DNA结合、转录和转录因子、蛋白翻译、细胞周期等相关表达差异的基因共341条,其中44条(比值>2)表达上调(占12.9%),297条(比值<0.5)表达下调(占87.1%)。结论:金龙蛇颗粒可引起MKN-45胃癌组织一系列基因表达的改变,金龙蛇颗粒抗胃癌的基因途径可能是多环节、多层次的结果。

金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植人胃癌MKN-45细胞凋亡的影响

目的：评价金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植入胃癌MKN-45细胞的抑制作用.方法：50只裸鼠建立原位移植人胃癌MKN-45细胞模型,随机分为模型组,金龙蛇颗粒高、中、低剂量组和5-FU干预组.各组裸鼠予以相应药物实施干预.观察各组荷瘤裸鼠一般情况,肿瘤生长情况及抑瘤率.流式细胞仪检测肿瘤细胞周期分布及细胞凋亡情况.采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI）双标记染色法鉴别早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞.电镜下观察肿瘤细胞的超微结构变化.结果：金龙蛇颗粒高、中、低剂量组的抑瘤率分别为68.13%、55.94%和50.31%,呈剂量依赖效应,与5-FU干预组抑瘤率比较,差异无统计学意义.金龙蛇颗粒各剂量组肿瘤细胞凋亡率为22.81%～38.54%,亦呈剂量依赖效应,且肿瘤细胞主要被阻滞于G0/G1期.AnnexinV-FITC/PI双标记染色结果显示,金龙蛇颗粒各剂量组以早期凋亡细胞居多,5-FU干预组则以晚期凋亡细胞和坏死细胞居多.结论：金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植人胃癌MKN-45细胞具有较好的抑制作用,促进MKN-45细胞凋亡可能是其抗肿瘤治疗的主要作用机制之一.

藤梨根提取物对人胃癌MKN-45细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨太白山藤梨根提取物(Radix Actinidiae extractive,RAE)在体外对胃癌MKN-45细胞增殖与凋亡的影响。方法:用0.01-100μg/ml浓度范围内的RAE和胃癌MKN-45细胞共培养24、48、72、96小时,采用MTT法检测RAE对MKN-45细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对MKN-45细胞凋亡及细胞周期分布的影响;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:RAE在体外能够显著抑制胃癌MKN-45细胞的增殖,且呈现浓度和时间依赖性;RAE对胃癌细胞的作用表现为周期特异性,使细胞阻滞于G0/G1期,进一步诱导细胞凋亡。对照组凋亡率为0.53%,1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml浓度的RAE干预胃癌细胞48小时后均出现凋亡峰,细胞凋亡率分别为3.27%、8.97%、12.6%。DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,不同浓度RAE处理的细胞样品中均可看到梯形凋亡条带,并呈现浓度依赖性。结论:RAE在体外对人胃癌MKN-45细胞有显著的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用,其作用机制可能是使胃癌细胞周期阻滞于G0/G1期。

槐耳醇提物抑制人胃癌细胞MKN-45增殖的实验研究

目的观察槐耳不同提取部位对人胃癌MKN-45细胞增殖的影响,并筛选其有效部位。方法用系统溶剂法将槐耳提取为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水五个部位后,用CCK-8显色法,检测不同部位不同浓度的槐耳醇提取物对MKN-45增殖的作用。结果槐耳石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇部位为抗肿瘤有效部位,其中以正丁醇部位效果最佳,其对MKN-45细胞半数抑制率(IC50)为56.142μg·m L-1。结论槐耳醇提物能抑制人胃癌MKN-45细胞增殖,其最有效部位为槐耳正丁醇部位。

槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45细胞生长和转移的实验研究

目的研究槐耳清膏对人胃癌MKN-45细胞在裸鼠体内生长和转移的抑制作用,并探讨其作用机制。方法采用BALB/c裸鼠建立人胃癌MKN-45细胞淋巴结转移模型,随机分为槐耳清膏组、空白对照组,每组20只。建模后,每5天测量裸鼠荷瘤并计算肿瘤相对体积(RTV);用药5周后处死裸鼠,Real-time q PCR检测肿瘤组织Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和VEGF表达水平。结果槐耳清膏组末次测得的足垫瘤RTV为(662.75±450.66)mm3,明显小于空白对照组的(1611.85±611.83)mm3(P<0.01)。槐耳清膏组淋巴结转移率8/20(40%)与对照组15/20(70%)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。槐耳清膏组肿瘤组织Wnt、β-catenin、N-cadherin和VEGF的△CT值分别为(11.36±1.32)、(11.31±1.76)、(12.82±2.22)、(13.22±1.52),均高于对照组的(9.48±2.07)、(9.37±1.88)、(7.74±2.64)、(11.04±1.61),而E-cadherin的△CT值(8.26±2.39)低于对照组的(10.64±1.48)(P<0.05)。结论槐耳清膏可抑制人胃癌MKN-45细胞在裸鼠上的生长及转移,其机制可能与抗血管生成和阻碍上皮间质转化(EMT)过程有关。

MS-275通过上调ROS释放选择性杀伤胃癌细胞

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275通过线粒体凋亡途径,选择性杀伤胃癌细胞的具体作用机制。方法:MS-275分别处理GES-1、MKN-45细胞,通过WST-1法检测细胞存活率,分析MS-275细胞毒性及选择性杀伤作用;通过流式细胞术检测线粒体膜电位变化,及ROS抑制剂对MS-275凋亡诱导作用的影响;Western blot、PCR分别检测处理后胃癌细胞中p21、p57、cyclin D1、cyclin E1、和TBP-2的mRNA及蛋白水平表达情况。结果:MS-275对正常胃黏膜上皮细胞GES-1存活率无显著性影响,但对胃癌细胞MKN-45影响显著(P<0.05)。MS-275对胃癌细胞MKN-45线粒体膜电位影响不显著,但能够诱导ROS显著升高,ROS抑制剂显著降低由MS-275诱导的ROS释放。MS-275显著激活肿瘤抑制基因p21、p57、TBP-2以及细胞周期蛋白相关基因cyclin D1、cyclin E1的表达。结论:MS-275通过促进细胞周期阻滞因子、凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因的表达,诱导ROS生成,选择性杀伤胃癌细胞。

化痰通瘀解毒方水提取物通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胃癌细胞株MKN-45上皮-间质转化及侵袭迁移

目的:观察化痰通瘀解毒方对人胃癌细胞MKN-45侵袭迁移能力和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响,并探讨其与Wnt/β-catenin信号通路的相关性。方法:以转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1) 10 ng/m L诱导MKN-45细胞构建EMT模型;采用Transwell小室实验和划痕愈合实验检测细胞的侵袭、迁移能力;采用Western Blot法检测EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平。结果:TGF-β1能够明显增强MKN-45细胞侵袭、迁移能力,诱导MKN-45细胞发生EMT:E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达上调;同时,TGF-β1能诱导MKN-45细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达上调。化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)均可显著抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞侵袭迁移及EMT:E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达下调;同时,化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)还可下调Wnt1和β-catenin蛋白表达,且上述结果中化痰通瘀解毒方在10、20、40μg/m L剂量组间存在剂量依赖性; Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939与化痰通瘀解毒方40μg/m L均可明显抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞EMT和侵袭迁移,且XAV939可协同化痰通瘀解毒方40μg/m L抑制TGF-β1诱导的EMT和侵袭迁移。结论:化痰通瘀解毒方能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制TGF-β1诱导的EMT,进而降低MKN-45细胞侵袭迁移能力。

胃癌细胞MKN-45外泌体携带miR-552对HUVEC细胞增殖、迁移和血管生成能力的影响

目的探讨MKN-45细胞外泌体(exosome)携带的微小RNA-552(miR-552)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖、迁移和血管生成能力的影响。方法(1)将MKN-45细胞分为MKN-45空白对照组(不转染任何质粒)、MKN-45 miR-552抑制组[转染抑制miR-552表达的质粒(miR-552抑制质粒)]、MKN-45阴性对照组[转染阴性对照质粒(空质粒)]。提取、纯化和鉴定MKN-45细胞外泌体,采用免疫印迹法检测外泌体标志物分化抗原63(CD63)、分化抗原9(CD9)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)蛋白的表达。(2)将HUVEC细胞分为HUVEC对照组(加入PBS溶液)、HUVEC-外泌体组(加入MKN-45细胞来源外泌体)、HUVEC-阴性对照外泌体组(加入转染阴性对照质粒的MKN-45细胞来源外泌体)和HUVEC-miR-552抑制外泌体组(加入转染miR-552抑制质粒的MKN-45细胞来源外泌体),采用外泌体示踪实验检测外泌体是否进入HUVEC细胞;采用实时荧光定量PCR法检测miR-552的表达;采用噻唑蓝法检测HUVEC细胞的增殖情况;采用Transwell小室法检测HUVEC细胞的迁移情况;采用血管生成实验检测血管生成能力。结果本研究成功从MKN-45胃癌细胞中提取了外泌体,透射电镜下观察外泌体均呈圆形或椭圆形,直径为100~150 nm,可见外泌体囊泡结构;免疫印迹法法检测到外泌体表面表达标志物CD63、CD9和TSG101蛋白。示踪实验结果显示,MKN-45细胞来源的外泌体成功被HUVEC细胞内化。与MKN-45空白对照组和MKN-45阴性对照组相比较,MKN-45 miR-552抑制组外泌体中的miR-552相对表达水平降低(P<0.05);与HUVEC对照组相比,HUVEC-外泌体组24、48和72 h的细胞增殖率较高,且迁移细胞数、小管生成节点数以及miR-552相对表达水平均升高(P<0.05);与HUVEC-阴性对照外泌体组相比较,HUVEC-miR-552抑制外泌体组24、48和72 h的细胞增殖率降低,且迁移细胞数、小管生成节点数以及miR-552相对表达水平均降低(P<0.05)。结论MKN-45细胞外泌体携带的miR-552可以显著促进HUVEC细胞的增殖、迁移以及血管生成。

热疗对胃癌细胞株化疗敏感性的影响

目的:探讨热疗时胃癌细胞株对紫杉醇(paclitaxel,TAX)敏感性的变化。方法:用对TAX敏感的胃癌细胞株MKN-45经浓度梯度递增法建立胃癌TAX耐药细胞株,命名为MKN-45/TAX。采用免疫细胞化学染色法检测MKN-45/TAX和MKN-45细胞中多药耐药相关基因(multi-drug resistance gene,MDR1)的表达;采用CCK-8法检测不同温度和不同TAX浓度作用下2种细胞的增殖抑制率;采用实时荧光定量–聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法、蛋白质印迹(Western blotting)法检测经靶向siRNA处理前后MDR1 mRNA和P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果:成功建立MKN-45/TAX。MDR1在MKN-45/TAX中高表达而在MKN-45中低表达。随着紫杉醇浓度的增加,其对MKN-45及MKN-45/TAX的增殖抑制率增加;42℃时紫杉醇对MKN-45/TAX的增殖抑制率降低,而对MKN-45的增殖抑制率则升高。转染MDR1 siRNA后MDR1 mRNA和P-gp的表达水平均下降。结论:热疗联合化疗可增强耐药胃癌细胞株对TAX的耐药性,而增强敏感胃癌细胞株对TAX的敏感性,其机制可能与MDR1表达有关。

亚油酸/二十二碳六稀酸对胃癌细胞凋亡作用

目的探讨不同比例亚油酸(LA)/二十二碳六稀酸(DHA)对人胃癌细胞株MKN-45的抑制作用。方法采用均匀设计法初筛出LA/DHA抑制MKN-45增殖的较佳比例,采用随机区组法确定促进胃癌细胞凋亡的最佳比例;采用LA/DHA最佳比例混合脂肪酸干预MKN-45裸小鼠移植模型6周,观察裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积变化及毒副反应情况;肿瘤组织HE染色观察肿瘤细胞形态学改变。结果经均匀设计和随机区组筛选,LA/DHA比例为1∶3时,浓度为40∶120μmol/L时,对肿瘤细胞的抑制效果最佳(P<0.05);与对照组比较,1∶3 LA/DHA混合脂肪酸高剂量组瘤体抑制率为21.97%,瘤重的抑制率为18.09%,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤组织病理切片显示,高剂量组和抗癌药物阳性对照组的肿瘤组织中出现不同程度坏死;高剂量组毒副反应不明显。结论LA/DHA比例为1∶3可诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡;LA/DHA高剂量组有一定抑瘤作用,并且无明显毒副反应。