RNA结合蛋白RBPMS调控急性髓系白血病细胞系THP-1增殖与迁移

目的研究具有多重剪接功能的RNA结合蛋白(RBPMS)对携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系THP-1功能的影响。方法使用GEO数据库分析造血系统中RBPMS的表达情况;通过慢病毒感染THP-1细胞,RT-qPCR和Western blot检测RBPMS过表达效率;通过高通量测序检测RBPMS过表达后对THP-1细胞转录组的影响。分别用CCK-8法和流式细胞仪检测RBPMS过表达对白血病细胞增殖以及迁移能力的影响。结果RBPMS在携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病干细胞中异常低表达。RBPMS过表达后THP-1细胞的增殖和迁移能力显著降低(P<0.0001,P<0.05)。结论RBPMS可以抑制携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系的细胞增殖与迁移。

乌索酸诱导人单核细胞白血病细胞株THP-1分化的研究

乌索酸是一种常见的五环三萜类化合物,本文考察了其对原单核白血病细胞株THP-1的分化诱导作用。乌索酸作用72h后,通过显微镜形态观察,部分THP-1细胞贴壁生长,形态具有向巨噬细胞分化的特征。结晶紫染色结果显示细胞贴壁程度呈剂量依赖型增长。利用流式细胞分析技术分化标志物,发现CD11b和CD14阳性细胞百分比均有显著上调。Western blotting结果表明乌索酸能上调分化相关蛋白C/EBPα的p42亚基并且下调分化负调控因子c-myc的蛋白水平,且对二者的表达调控作用具有浓度和时间相关性。因此,乌索酸能够诱导THP-1细胞向单核/巨噬细胞方向分化。其作用机制可能是上调C/EBPα的p42亚基,进而下调c-myc,从而达到分化诱导作用。

EGCG干预抗β_2GPI/β_2GPI复合物对THP-1细胞的诱导活化作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)活化的作用。方法用一定剂量的EGCG、脂多糖(LPS)、抗β2GPI/β2GPI复合物等不同刺激物处理THP-1细胞,实时荧光定量PCR检测细胞组织因子(TF)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达;发色底物法检测TF活性;ELISA测定TNF-α蛋白的表达。结果 50 mg/L EGCG能抑制抗β2GPI/β2GPI复合物刺激的THP-1细胞TF mRNA和活性的表达(t值为6.97、3.89,P均<0.05),同时下调该复合物诱导的THP-1细胞TNF-αmRNA和蛋白质的表达水平(t值为3.23、4.65,P均<0.05)。结论 EGCG可干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF及TNF-α的表达,抑制THP-1细胞活化。

刚地弓形虫培养上清抑制THP-1细胞株增殖

目的提取弓形虫体外细胞共培养上清,研究上清对人急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖及细胞周期的影响。方法取对数生长期的THP-1细胞(浓度为5×105/mL)分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入含10%胎牛血清RPMI-1640,实验组加入相同体积不同数量(2×107、4×107和8×107/mL)弓形虫速殖子培养上清孵育不同时间后,MTT法检测THP-1细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测细胞核转录因子NF-κB/P65与周期蛋白CYCLIND1表达或活性。结果弓形虫培养上清呈时间剂量依赖性抑制THP-1细胞株增殖,使细胞周期在G0/G1期产生阻滞;8×107/mL数量组的THP-1细胞48 h抑制率可达(23.71±0.56)%,G0/M1期细胞比例达(58.53±1.03)%,较对照组比较有明显差异(P<0.05),且处理组THP-1细胞株的NF-κB/P65、cyclin D1蛋白表达量下降。结论刚地弓形虫培养上清能够通过NF-κB信号途径下调cyclin D1蛋白表达引起人急性单核细胞白血病细胞株THP-1 G0/G1期阻滞。

弓形虫感染对THP-1巨噬细胞极化影响的研究

目的探讨弓形虫感染对体外诱导的人外周血单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)极化特点的影响。方法用佛波酯(PMA)诱导THP-148h使之由悬浮的单核细胞诱导为贴壁的巨噬细胞,体外选择不同时间点感染弓形虫,用Diff染色分析弓形虫在细胞内的增殖情况。Western blot检测极化相关蛋白,Q-PCR检测mRNA的表达情况。结果成功诱导得到贴壁的巨噬细胞模型,感染弓形虫后,M1型巨噬细胞标志性蛋白iNOS及M2型巨噬细胞标志型蛋白Arg-1 36h表达量与对照组差异明显(t=10.23,P<0.05)。Q-PCR的结果显示不同的处理组IL-1、IL-12、iNOS和TNF-α逐渐减少,而IL-10、Arg-1呈逐渐增加,到36h达到顶峰(t=9.587,P<0.05)。结论弓形虫RH株感染THP-1巨噬细胞后可以在胞内生长增殖,THP-1细胞感染后向M2型巨噬细胞方向极化。

人急性单核细胞白血病细胞系SHI-1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究

本研究确定人急性单核细胞白血病细胞系SHI-1在裸鼠体内的高致瘤性,并对其成瘤机制进行初步探讨。将SHI-1细胞接种至裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;取肿瘤组织行病理检测、R显带核型分析;RT-PCR检测MLL-AF6融合基因和VEGF基因的转录;明胶酶谱法检测培养上清中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和MMP-2的表达;体外穿膜实验观察迁移能力。结果表明:注射SHI-1细胞的16只裸小鼠均于皮下出现肿块;瘤体由白血病细胞组成;注射的裸鼠中有MLL/AF6融合基因和VEGF基因的转录;在无血清培养上清中MMP-9和MMP-2的表达明显高于对照细胞;SHI-1细胞有较强的迁移能力,MMP-2的阻断抗体可显著抑制其体外迁移能力。结论:SHI-1在裸鼠体内有极高的成瘤率,其机制可能与p53基因的异常、高水平VEGF基因的转录、金属蛋白酶的高表达和较强的体内浸润能力有关。

630 nm LED红光照射后THP-1来源M0巨噬细胞的蛋白质组学分析

目的分析630 nm发光二极管(light emitting diode,LED)产生红光照射对人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源M0巨噬细胞的作用与机制。方法用佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)处理THP-1细胞,制备THP-1来源M0巨噬细胞,并使用强度为28.8 J/cm^(2)的630 nm LED红光照射M0巨噬细胞,随后采用非标定量蛋白质组学分析方法筛选差异表达蛋白并进行基因本体论(gene ontology,GO)注释和富集;通过string在线网站(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape软件分析蛋白质互作情况,根据关键蛋白的作用,分析630 nm LED红光照射与THP-1来源M0巨噬细胞的关系。结果蛋白质组学结果显示,630 nm LED红光照射THP-1来源M0巨噬细胞后,62个差异表达蛋白能够显著富集在细胞对刺激反应、线粒体膜电势负性调控和平滑肌细胞增殖的调控等相关生物学进程。在显著性排名前10的生物学进程中,细胞对刺激反应相关生物学进程占70%,主要为对糖刺激反应(4个进程)、对神经生长因子反应(2个进程)等;进一步分析细胞应对刺激相关生物学进程中涉及的8个蛋白间蛋白互作情况结果显示,转录因子叉头箱蛋白O3亚基(forkhead box O3,FOXO3)、炎症相关蛋白前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)或称环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和炎症因子白介素-18(interleukin-18,IL-18)为关键互作蛋白,并且在630 nm LED红光照射后的THP-1来源M0巨噬细胞中,FOXO3和IL-18的蛋白水平显著升高(P<0.05),PTGS2(COX-2)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论630 nm LED红光照射对THP-1来源M0巨噬细胞的作用,类似于糖和神经生长因子对细胞的刺激反应;通过上调THP-1来源M0巨噬细胞中FOXO3蛋白的表达抑制M0巨噬细胞中PTGS2(COX-2)介导的炎症状态。

三氧化二砷联合双氢青蒿素对THP-1细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究三氧化二砷联合双氢青蒿素对人急性单核细胞白血病(AML)细胞株THP-1细胞增殖、周期及凋亡的影响并探究其作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测三氧化二砷、双氢青蒿素、三氧化二砷联合双氢青蒿素对THP-1细胞增殖的影响,流式细胞术AnnexinV/碘化丙啶(PI)双染实验检测细胞周期和凋亡的变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),裂解半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达,在高内涵显微镜下观察药物作用后细胞形态的变化。结果:与空白组比较,不同浓度的三氧化二砷、双氢青蒿素对THP-1细胞的增殖均具有显著抑制作用(P<0.01),且成剂量和时间依懒性;作用48 h,与同等剂量的三氧化二砷或双氢青蒿素单独应用比较,1μmol·L^-1三氧化二砷与2μmol·L^-1双氢青蒿素联合应用对THP-1细胞增殖的抑制作用显著增强(P<0.01),且细胞阻滞在G1期(P<0.01),并显著下调Bcl-2和Caspase-3的表达(P<0.01),同时明显上调cleaved Caspase-3的表达水平(P<0.05)。结论:三氧化二砷联合双氢青蒿素对THP-1细胞具有明显抑制增殖和诱导凋亡的作用,其作用机制可能与阻滞细胞G1期,下调Bcl-2和Caspase-3蛋白表达,上调cleaved Caspase-3蛋白表达有关。

刚地弓形虫培养上清抑制THP-1细胞增殖及诱导凋亡的研究

摘要：目的提取弓形虫体外细胞共培养上清，并研究上清对人急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法收集对数生长期的THP-1细胞以5X10^7／ml细胞浓度接种于不同培养瓶中，对照组加入含10％胎牛血清的RPMll640，实验组加入相同体积不同数量（2×10^7／ml、4X10^7／ml、8×10^7／m1）弓形虫速殖子培养上清，采用四甲基氮噻唑蓝（MTY）法检测吸光度（A490值）并计算THP-1细胞增殖抑制率；倒置显微镜下观察细胞形态变化；Annexin-V-FITC／PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化，以Western印迹方法分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性。结果MTY法检测结果弓形虫培养上清呈时间剂量依赖性抑制THP-1细胞株增殖，倒置显微镜下观察处理组细胞有发泡现象和凋亡小体出现。流式细胞仪检测弓形虫感染后的THP-1细胞凋亡率较对照组有升高趋势（P〈0．05），呈量效依赖性，Westernblot检测刚地弓形虫培养上清作用于THP-l细胞48h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组的比值分别有明显的升高与降低（P〈0．05）。结论刚地弓形虫速殖子培养上清对体外培养THP-l细胞增殖有明显的抑制作用，并可诱导THP-1细胞凋亡。

细胞间隧道纳米管介导的线粒体转运诱导急性单核细胞白血病细胞抵抗凋亡的研究

目的观察人类急性单核细胞白血病(AML-M5)细胞系THP-1与骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)之间隧道纳米管(TNTs)结构的形成;探讨TNTs中线粒体转运对THP-1细胞凋亡的影响及线粒体在TNTs中转运的分子机制。方法使用特异性荧光染料分别对线粒体、细胞骨架蛋白F-Actin和细胞核进行荧光标记,共聚焦显微镜观察BM-MSCs与THP-1细胞间TNTs的形成及TNTs中线粒体的传递。BM-MSCs与THP-1细胞共培养5 d后运用流式细胞术检测THP-1细胞凋亡;共培养体系分为4组:直接共培养(SC组)、Transwell透膜共培养(TC组)、直接共培养体系中加入细胞松弛素(TNTs抑制剂)Latrunculin B(LC组)、无BM-MSCs而仅有培养液(MC组);Western blot检测细胞器转运相关马达蛋白(KIF5B)表达水平。结果 BM-MSCs与THP-1细胞间可观察到TNTs形成,BM-MSCs中线粒体通过TNTs单向传递到THP-1细胞,并未观察到线粒体逆向传递。Annexin V-FITC/PI检测THP-1细胞凋亡结果显示,SC组跟LC组凋亡率较MC组明显减低( P <0.01),LC组高于SC组( P <0.01),TC组较SC组和LC组明显升高( P <0.01),TC组与MC组凋亡率无明显差异( P >0.05)。BM-MSCs中 KIF5B表达水平明显高于THP-1细胞( P <0.001),Rotenone处理BM-MSCs后显著抑制KIF5B的表达( P <0.01)。结论 BM-MSCs线粒体通过TNTs向THP-1细胞单向传递,THP-1细胞摄取BM-MSCs线粒体后可能诱导凋亡抵抗;细胞间线粒体转运可能与马达蛋白KIF5B相关。

miR-485-5p通过靶向白介素-1受体关联激酶4调控巨噬细胞炎症反应

目的探究miR-485-5p对白介素-1受体关联激酶4(IRAK-4)的靶向作用,研究其在巨噬细胞模型炎症反应中的调控作用。方法合成miR-485-5p模拟物(mimics)及其抑制剂(inhibitors),分别转染HEK-293T细胞,RT-PCR检测miR-485-5p的表达水平。根据miRNA靶向作用预测数据分析选定IRAK-4作为研究的靶基因,构建IRAK-43'UTR及其突变体萤火虫-海肾双荧光素酶报告基因系统,通过检测在细胞模型中过表达/抑制表达miR-485-5p后对荧光素酶活力的影响,验证miR-485-5p与IRAK-4之间的靶向关系,Westernblot检测IRAK-4蛋白质表达水平。构建巨噬细胞模型,将miR-485-5pmimics及inhibitors分别转染巨噬细胞,RT-PCR检测靶基因IRAK-4mRNA的表达水平,ELISA检测上清中下游致病因子IL-6、IL-17、IL-18的表达。结果通过实验证实miR-485-5p与IRAK-4存在靶向作用。细胞模型中,与对照组相比,转染miR-485-5pmimics后miR-485-5p表达水平升高了17.15倍(P<0.01),转染miR-485-5pinhibitors后miR-485-5p表达水平降低了79.80%(P<0.05)。过表达miR-485-5p后明显抑制IRAK-4的蛋白水平表达及mRNA相对含量,抑制下游炎性因子IL-6、IL-17、IL-18的表达(P<0.05);抑制表达miR-485-5p,则上调IRAK-4的蛋白水平及mRNA相对含量,可显著提高IL-6、IL-17、IL-18的释放(P<0.05)。结论证实miR-485-5p可以通过对靶向IRAK-4的特异性序列,调控下游炎性细胞因子的表达,进而调控细胞的炎症反应。

雷公藤内酯酮对SHI-1细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨雷公藤内酯酮(TN)对人急性单核细胞白血病(AML)细胞株SHI-1细胞增殖、周期、凋亡以及凋亡相关蛋白表达水平的影响,并探究其可能的作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测20,40,80,160,320 nmol·L^(-1)的雷公藤内酯酮作用SHI-1细胞48,72 h对细胞增殖的抑制作用,流式细胞术碘化丙啶(PI)单染法检测雷公藤内酯酮作用前后SHI-1细胞周期的变化,流式细胞术AnnexinV/PI双染法检测雷公藤内酯酮作用前后SHI-1细胞凋亡的变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测80,160 nmol·L^(-1)雷公藤内酯酮作用于SHI-1细胞前后半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)和核转录因子-κB(NF-κB)的蛋白表达。结果:分别作用48,72 h,与空白组比较,40,80,160,320 nmol·L^(-1)雷公藤内酯酮对SHI-1细胞增殖均具有显著抑制作用(P<0.01),且具有剂量依赖性;雷公藤内酯酮160,320 nmol·L^(-1)可诱导SHI-1细胞凋亡(P<0.01),并且雷公藤内酯酮160 nmol·L^(-1)可使SHI-1细胞S期比例降低(P<0.01)。此外,与空白组比较,雷公藤内酯酮80,160 nmol·L^(-1)组NF-κB蛋白表达水平显著下调(P<0.05,P<0.01),雷公藤内酯酮160 nmol·L^(-1)组Caspase-3,Caspase-8蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论:雷公藤内酯酮可以体外抑制SHI-1细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与雷公藤内酯酮降低SHI-1细胞S期比例,下调Caspase-3,Caspase-8以及NF-κB的蛋白表达水平有关。

视黄醇类X受体激动剂通过抑制蛋白激酶C的激活抑制高糖诱导的人急性单核细胞白血病细胞氧化应激反应

目的探讨视黄醇类X受体(RXR)激动剂对高糖诱导人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)产生的氧化应激的影响及作用机制。方法体外培养THP-1,以25mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞仪和荧光显微镜的方法检测细胞内的活性氧族水平。分别应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹的方法检测THP-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基NOX2/gp91phox和p22phox的表达水平,用免疫印迹方法检测蛋白激酶C(PKC)蛋白的磷酸化水平。结果在高糖环境下(葡萄糖终浓度为25mmol/L),THP-1内活性氧族生成明显增加(9.54±0.49比2.3±0.58,P<0.05),NADPH氧化酶NOX2/gp91phox和p22phox亚基的mRNA和蛋白表达水平明显上调。RXR激动剂9顺式维甲酸(9-cis-RA)可明显抑制高糖诱导的活性氧族生成及NADPH氧化酶NOX2/gp91phox和p22phox亚基表达水平的增加幅度,且具有浓度依赖性;10-7mol/L浓度的SR11237(RXR的特异性配体)与等浓度9-cis-RA具有相似的抑制效应。PKC抑制剂LY3335(20μmol/L)明显抑制高糖环境下活性氧族的生成及NADPH氧化酶NOX2/gp91phox和p22phox亚基蛋白表达水平的增加幅度。RXR激动剂9-cis-RA和SR11237可抑制高糖诱导的PKC蛋白的磷酸化。结论 PKC的活化参与了高糖诱导THP-1产生的氧化应激反应,RXR激动剂通过抑制PKC蛋白的活化对抗高糖诱导THP-1产生的氧化应激反应。

生物活性透明质酸对脂多糖诱导的人树突状细胞和巨噬细胞炎症应答作用

目的探讨经人透明质酸酶PH20特异处理的重组HA,即生物活性透明质酸(B-HA)对脂多糖(LPS)诱导的人树突状细胞(DC)和巨噬细胞炎症应答的影响。方法 DC细胞和人急性单核细胞白血病单核细胞株(THP-1)经不同浓度的B-HA预先处理,加入LPS刺激不同时间,收集细胞和培养上清,采用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测细胞因子mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 THP-1细胞实验中,与LPS组相比,B-HA 20 mg/ml不仅能够显著降低促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)的表达量,同时能够显著增加抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的表达量。其细胞中TNF-α、IL-8和IL-10 mRNA表达水平分别为24.41±1.94、35.76±4.19和14.99±0.07,而LPS组分别为38.48±1.47、62.7±1.93和2.27±0.16,差异均具有统计学意义(t=5.781、P=0.0290,t=5.695,P=0.0300,t=15.20、P=0.0040)。细胞上清中三者蛋白表达水平分别为(1 609.00±75.66)pg/ml、(213.10±9.14)pg/ml和(496.3±41.92)pg/ml,LPS组分别为(3 018±102.8)pg/ml、(587.4±3.140)pg/ml和(243.3±20.23)pg/ml,差异均具有统计学意义(t=11.04、P=0.0080,t=38.74、P=0.0007,t=5.434、P=0.0320)。在人外周血分化的DC细胞实验中,B-HA对细胞因子TNF-α、IL-8和IL-10的表达均无显著影响(P均>0.05)。结论 B-HA能有效调节人巨噬细胞炎性因子的表达,抑制其炎症反应;对人DC细胞的炎症反应无显著影响,提示B-HA对人炎性免疫细胞的炎症反应作用具有选择性。