葡萄籽原花青素增强X射线辐射敏感性的实验研究

目的:研究葡萄籽原花青素(GSPs)对人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞和人白血病K562细胞的X射线增敏作用,并探讨其作用机制。方法:应用SRB法和集落形成法测定GSPs对三株细胞的X射线增敏作用,单因素方差分析确定各因素对细胞杀伤的贡献,单击多靶模型曲线拟合计算增敏比。结果:SRB检测结果表明,GSPs可以抑制三株细胞的增殖,呈现时间和剂量依赖效应;但对不同细胞的增殖抑制作用差异较大,对人白血病K562细胞的抑制作用最强,对人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞的抑制作用较弱;对X射线增敏作用结果表明,GSPs对人白血病K562细胞的增敏作用最强,最佳增敏剂量为6.25～12.5μg/mL,对人肝癌HepG2和人宫颈癌Hela细胞的增敏作用相似,最佳增敏剂量为12.5～25μg/mL;集落形成法检测结果表明,应用增敏剂量的GSPs后,对人白血病K562细胞表现出较好的辐射增敏作用,平均致死剂量D0值和准阈剂量Dq减小,细胞对X射线辐射敏感性增加,亚致死损伤修复减少,增敏比为1.94。结论:GSPs可以增强肿瘤细胞对X射线的敏感性,最佳增敏剂量为12.5～25μg/mL,其机理可能通过抗氧化作用,调节细胞细胞内氧平衡,诱导细胞产生G1期阻滞而发挥辐射增敏作用。

大豆异黄酮及其衍生物对宫颈癌细胞增殖的影响

近年来的研究发现大豆异黄酮及其衍生物具有抗癌、抗氧化、抗突变等多种药理学作用。目前宫颈癌仍是严重威胁广大女性生命的恶性肿瘤之一,因此开发新的药物非常重要。本文对大豆异黄酮及其衍生物对宫颈癌细胞(Hela、CaSki、Me180、Siha)增殖方面的影响进行了综述,并对其作用途径进行了归纳总结,为研究开发宫颈癌药物提供了新思路。

动物细胞系的染色体组型与遗传变异率分析

在建立国内首家犬、猫、猴、鼠传代细胞库，即７种动物肾细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２、ＭＡ－１０４、ＢＨＫ－２１）的种子库和工作库的基础上，通过细胞染色体组型、Ｇ带核型、染色体数目变异率、结构畸变率分析，了解７种细胞系传代培养不同代次的染色体变异情况。以相应的细胞株皮下接种裸鼠形成肿瘤实验、软琼脂细胞克隆形成率与植物凝集素作用下细胞凝集实验为对照，筛选出无致癌／致瘤性、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２）或极低致癌性的ＭＤＣＫ细胞系用于制苗，发现肿瘤细胞系高变异率株可在裸鼠体内快速选育成功。细胞系染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性，得到一些１００％成瘤和１００％不成瘤的细胞株并探讨了与染色体组型的关系。对于肿瘤的发病机理及实验治疗，都是非常好的模型。一些细胞系不仅成瘤而且还可转移（致恶性横纹肌样瘤的ＢＨＫ－２１和Ｖｅｒｏ细胞株），其他致瘤细胞株只成瘤不转移或不明显转移。

COX-2在VEGF-C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用研究

目的检测血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和环氧合酶-2(COX-2)在人宫颈癌细胞系中表达,探讨二者之间的关系及COX-2在VEGF-C介导的人宫颈癌细胞生物学行为中的作用。方法用Western blot方法检测VEGF-C和COX-2在HeLa、Siha、C33a和Caski等4株宫颈癌细胞中的表达;用特定浓度的COX-2特异性抑制剂NS398处理HeLa细胞,评估其对HeLa细胞的增殖、转移产生的影响。结果 VEGF-C和COX-2蛋白在4株宫颈癌细胞中均有表达,且在不同细胞株中二者表达强弱一致。用NS398处理HeLa细胞后,其VEGF-C蛋白表达明显降低,且细胞凋亡率增加。NS398可诱导HeLa细胞增殖活性降低(P<0.05),且呈剂量依赖模式。Transwell实验结果显示NS398处理组细胞侵袭力为(25.45±3.67)%,较对照组(40.38±0.72)%明显减弱(P<0.05)。结论 VEGF-C和COX-2均在人宫颈癌细胞中表达,且COX-2与VEGF-C表达之间有一定的相关性。COX-2可能是宫颈癌细胞中VEGF-C表达的一个调节者,其抑制剂NS398对于VEGF-C介导的肿瘤生长和转移有一定抑制作用。

土贝母苷甲在人宫颈癌HeLa细胞内对线粒体的影响

目的:探讨线粒体在土贝母苷甲(TBMS1)诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中的作用。方法:流式细胞仪测定线粒体膜电位(ΔΨm)、琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂片和蛋白质免疫印迹法检测细胞色素c(cyt c)的表达。结果:TBMS1引起人宫颈癌HeLa细胞凋亡,使得ΔΨm下降,释放入胞质的cyt c增加,并具有时间、剂量依赖性;TBMS1还可直接作用于分离的鼠肝脏线粒体,使之释放cyt c;TBMS1的这种作用部分能够被线粒体膜保护剂环孢菌素A(CsA)阻断。结论:线粒体途径是TBMS1诱导的HeLa细胞凋亡的途径之一。

异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞增殖影响的实验研究

目的:探讨异紫堇定碱(Isocorydione)对人宫颈癌Siha细胞增殖的影响。方法:以100、200、400、800、1 200μmol/L浓度的异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞体外干预,分别作用24、48、72 h后,采用MTT法检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞生长增殖的作用;流式细胞仪检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞周期的影响;结合Hoechst染色观察处理后Siha细胞核微形态的变化;Western Blot法检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞作用后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响。结果:MTT结果显示不同浓度的异紫堇定碱作用于人宫颈癌Siha细胞后具有明显的抑制其增殖的作用,呈剂量-时间依赖关系(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示400μmol/L的异紫堇定碱作用于人宫颈癌Siha细胞后,细胞周期发生明显改变,其中G1和S期细胞比例变化不明显,但G2期细胞明显减少(P<0.05);Hoechst染色结果显示,与对照组比较,400μmol/L的异紫堇定碱作用于Siha细胞48 h后形态缩小、细胞核固缩,出现核碎裂形成凋亡小体;Western Blot结果显示400μmol/L的异紫堇定碱分别作用于人宫颈癌Siha细胞24、48、72 h后,其Bax蛋白表达增加,而Bcl-2蛋白表达逐渐减少,Bax/Bcl-2比值增加,Caspase-3蛋白表达逐渐增多。结论:异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞增殖具有明显的抑制作用,其促使细胞发生凋亡行为可能与线粒体凋亡途径的蛋白有关。

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。

个体化裸鼠荷人肺癌肿瘤模型的建立

目的:建立人肺癌个体化可传代组织块动物模型。方法:组织块移植组将直径2 mm的人肺癌新鲜标本癌组织块移植于BALB/C裸鼠背部皮下组织内,每例人肺癌新鲜标本均移植入5只裸鼠体内,成瘤者为第1代。取第1代移植瘤组织块以相同方法每例标本移植于另5只BALB/C裸鼠背部皮下组织内,成功者为第2代。重复上述传代方法得到第3代移植瘤。将人肺癌细胞株A549、H1795分别移植于BACL C裸鼠背部皮下组织内,成瘤达500 mm3后取癌组织块。分别取实验组的原代人肺癌肿瘤及第1、2、3代移植瘤部分组织,及作为对照的细胞系移植瘤组织,固定于10%福尔马林溶液中,石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察比较其形态异同。结果:组织块移植组瘤细胞不仅保留了人肺癌细胞的异型性,还保持原有排列结构;而作为对照的细胞系移植瘤细胞失去了原有的排列结构,仅保留了癌细胞的异型性。结论:利用不同患者的手术切除肺癌标本所建立的裸鼠荷人肺癌肿瘤模型具有个体化特征,为肺癌个体化治疗的研究提供依据。

γ-分泌酶抑制剂DAPT对人宫颈癌Hela细胞体外增殖的影响

目的探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT对人宫颈癌Hela细胞系增殖和凋亡的影响。方法体外培养人宫颈癌Hela细胞;MTT法检测不同浓度DAPT(1.0、5.0、10.0μmol/L)对Hela细胞增殖的抑制作用;流式细胞术分析不同浓度DAPT对Hela细胞凋亡率及细胞周期分布的影响。结果 3种浓度的DAPT均能显著抑制Hela细胞的增殖,抑制率分别为22.847%、32.492%、46.565%,作用呈明显剂量依赖性;不同浓度的DAPT能使Hela细胞凋亡率明显增加,分别为,且使S期、G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例显著增加,作用呈剂量依赖性。结论 DAPT对体外培养的人宫颈癌Hela细胞具有抑制增殖、调节细胞周期、诱导凋亡的作用。

人舌鳞癌Tca8113细胞株中c-erbB-2、bcl-2表达

目的探讨口腔癌肿瘤细胞中c-erbB-2、bcl-2基因的表达水平及其在肿瘤形成、发展过程中的作用.方法采用荧光定量RT-PCR实验技术检测人舌鳞癌Tca8113细胞株中c-erbB-2、bcl-2基因mRNA表达水平.结果分光光度计检测纯度A260/A280均在1.8～2.0,通过基因表达扩增曲线图与看家基因GAPDH校正,得出目的基因的相对含量高.结论 bcl-2与c-erbB-2基因的表达水平在人舌鳞癌Tca8113细胞株中显著升高,可能在肿瘤形成、发展过程中起到一定的作用.

丝裂霉素C对人膀胱癌T24细胞Mta-1 mRNA、Mta-1蛋白表达的影响及意义

目的研究人膀胱癌T24细胞株中Mta-1 mRNA和Mta-1蛋白的表达,及丝裂霉素C(MMC)对人膀胱癌T24细胞株中Mta-1 mRNA和Mat-1蛋白表达的影响。方法人膀胱癌T24细胞株培养,MMC干预,用原位杂交和免疫组化检测Mta-1 mRNA和Mta-1蛋白的表达。结果人膀胱癌T24细胞株中Mta-1 mRNA阳性细胞表达率MMC组(35.1±9.0)%明显低于对照组组(61.9±12.8)%;Mta-1蛋白阳性细胞表达率MMC组(36.0±8.03)%亦明显低于对照组(57.7±10.1)%,P<0.01。结论人膀胱癌T24细胞株中存在Mta-1 mRNA和Mta-1蛋白的高表达,MMC对人膀胱癌T24细胞株中Mta-1 mRNA和Mta-1蛋白的表达具有抑制作用。

人鼻咽癌CNE－2Z细胞的不同转移潜能克隆株在严重联合免疫缺陷小鼠体内的检验和比较研究

将人类鼻咽癌不同克隆株的细胞悬液移植在严重联合免疫缺陷（ＳＣＩＤ）小鼠和ＢＡＬＢ／ｃ（ｕｎ／ｕｎ）裸小鼠的颈背侧皮下，５６ｄ后处死全部动物进行观察。结果发现，在ＳＣＩＤ小鼠体内移植后ＣＮＥ２Ｌ２为高转移克隆株，其淋巴结转移率为１００％，肺转移率为７１％；而ＣＮＥ２Ｌ４为低转移克隆株，其肺转移率为１３％，淋巴结未见癌转移。这是从１个细胞母系中新筛选出的１个高转移和１个低转移的癌细胞克隆株。实验结果还显示，同ＢＡＬＢ／ｃ（ｕｎ／ｕｎ）裸小鼠相比，ＳＣＩＤ小鼠的恶性表型的表达能力高。另外，皮下移植时肿瘤细胞的数量可能与转移表型的表达有相关性，移植的瘤细胞数越多，转移率越高，反之亦然。

米非司酮对人宫颈癌HeLa细胞生长及其NF-κB p65表达的影响

目的探讨米非司酮(mifepristone,MIF)对人子宫颈癌HeLa细胞增殖及其NF-κB p65蛋白表达水平的影响。方法体外培养人子宫颈癌HeLa细胞,采用MTT法观察不同浓度MIF(5、10、20μmol/L)对HeLa细胞增殖的抑制作用;采用Western blot法检测MIF对HeLa细胞中NF-κB p65蛋白表达水平的影响。结果3个浓度的MIF均能显著抑制HeLa细胞的增殖,呈剂量依赖性;MIF可以使HeLa细胞中NF-κB p65蛋白表达水平下降。结论MIF对宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显的抑制作用,并且下调HeLa细胞NF-κB p65蛋白的表达。

抑制c-raf-1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的:探讨用反义技术抑制癌基因c-raf-1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响。方法:设立空白对照组、c-raf-1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)作对照,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后c-raf-1表达水平的变化。用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达。结果:c-raf-1反义寡核苷酸能有效抑制c-raf-1癌基因的表达,经脂质体介导的c-raf-1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白的表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P<0.01)。结论:c-raf-1反义寡核苷酸通过抑制c-raf-1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性。其辐射增敏作用可能与c-raf-1反义寡核苷酸抑制了辐射抵抗信号转导途径。

广西眼镜蛇毒细胞毒素对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞的抑制作用研究

目的 :研究广西眼镜蛇毒细胞毒素对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用。方法 :通过 Sephadex G- 5 0 ,CM- Sepharose CL- 6 B柱层析从广西眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 ,应用四氮唑蓝 (MTT)法测定其对人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的体外细胞毒作用及其量效关系 ,并与粗毒的抑瘤作用进行比较。结果 :从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素 (CTXCM- 5 ) ,其对体外培养的人卵巢癌细胞和宫颈癌细胞株的抑制作用呈明显的剂量依赖关系 ,抑制率随剂量增加而呈迅速上升的趋势 ,其作用 2 4h的 IC50 分别为 1.0 5 ,1.30 m g/L,其与粗毒相比 ,抑瘤作用更为显著。结论

植酸酮对宫颈癌细胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响

目的观察植酸酮对宫颈癌细胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响。方法体外培养Caski细胞株(含HPV16)与Hela细胞株(含HPV18),将所有细胞分成实验1、2、3、4组和对照组,每组均包含Caski细胞和Hela细胞。实验1、2、3、4组分别加入含58.6、117、586、5 860 mg/L植酸酮的培养液,对照组加入不含植酸酮的培养液。各组培养72 h后,采用real-time PCR法分别检测HPV16/18 E6/E7 mRNA,采用Western blotting法检测E6/E7蛋白。结果实验1、2、3、4组同一型别细胞中E6/E7 mRNA及蛋白相对表达量低于对照组,且实验1、2、3、4组E6/E7 mRNA及蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05)。各实验组内,Caski细胞中E6/E7 mRNA相对表达量低于Hela细胞(P均<0.05)。各实验组内同一型别细胞中,E6 mRNA相对表达量低于E7 mRNA(P均<0.05)。结论植酸酮可下调人宫颈癌细胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表达,且作用呈剂量依赖性;植酸酮对HPV16 E6/E7 mRNA的抑制作用强于HPV18 E6/E7 mRNA,并可能以抑制E6 mRNA表达为主导。

Artemis对人肝癌细胞系BEL-7402/5FU DNA损伤的影响

目的探讨转染sh Artemis干扰质粒对人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤的影响。方法将人肝癌细胞分为正常对照组、脂质体对照组、空质粒对照组和转染sh Artemis干扰质粒实验组(sh Artemis实验组);建立DNA损伤模型,分别用0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用BEL-7402/5FU细胞24和48 h,MTT法检测细胞活性,Western blot观察磷酸化组蛋白H_2AX(γ-H_2AX)的表达;转染Artemis干扰质粒,检测Artemis、γ-H_2AX表达;彗星实验检测DNA的损伤。结果 0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用48h后肝癌细胞活力明显下降(P<0.05);丝裂霉素C刺激细胞48 h后,γ-H_2AX的表达量随着药物浓度的增加而增加;转染sh Artemis干扰质粒后,γ-H_2AX的表达量较正常对照组增加(P<0.05);sh Artemis实验组较正常对照组拖尾DNA量增加(P<0.05)。结论丝裂霉素C能够诱导肝癌细胞损伤;转染sh Artemis干扰质粒促进丝裂霉素C诱导的人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤。

紫杉醇脂质体对宫颈癌HeLa细胞生长及其claudin-7表达的影响

目的 探讨注射用紫杉醇脂质体对人宫颈癌HeLa细胞增殖及claudin-7蛋白表达水平的影响.方法 体外培养人宫颈癌 HeLa细胞,采用 MTT法观察不同浓度紫杉醇脂质体（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）对HeLa细胞增殖的抑制作用;采用Western blot法检测HeLa细胞claudin-7蛋白表达水平在不同浓度紫杉醇脂质体作用下的变化.结果 5个浓度的紫杉醇脂质体均能显著抑制HeLa细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性;Western blot显示HeLa细胞经不同浓度紫杉醇脂质体处理48 h后,随着紫杉醇脂质体浓度的增高,claudin-7蛋白表达逐渐减弱.结论 紫杉醇脂质体对宫颈癌HeLa细胞体外生长具有明显的抑制作用,HeLa细胞claudin-7蛋白的表达在紫杉醇脂质体影响下是下调的.

异常黑胆质成熟剂总黄酮对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂(ASMq)总黄酮对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响,为ASMq的利用和开发提供理论依据。方法采用常规细胞株及细胞培养、传代方法,对HeLa细胞进行培养、传代,取对数生长期细胞并进行药物干预,通过MTT(检测细胞存活和生长的方法)探讨其抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的作用,倒置显微镜观察细胞形态学变化,荧光倒置显微镜观察细胞凋亡的动态情况。检测ASMq总黄酮作用下HeLa细胞总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量。结果 MTT实验结果表明,不同时间、不同浓度的ASMq总黄酮均具有抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的作用,其中浓度为400μg/mL、作用时间为72h时,作用较为明显。倒置显微镜细胞形态学观察可见,给药组中悬浮细胞增多,细胞质混浊,细胞胞体缩小、变圆、皱缩,核固缩碎裂,细胞折光性减弱,细胞内出现颗粒样物质,培养液中有较多的细胞碎片。荧光倒置显微镜观察可见,ASMq总黄酮浓度为100μg/mL时,随着时间的延长细胞发生的凋亡现象较为明显。当作用时间为24h时,随着浓度的增高细胞发生的凋亡现象较为明显;ASMq总黄酮作用于HeLa细胞24、48、72h后,不同剂量均增加HeLa细胞T-AOC及T-SOD、GSH含量,差异有统计学意义(P<0.05),其中高剂量组较为明显。结论ASMq总黄酮对人宫颈癌HeLa细胞增殖具有抑制作用,能够增强人宫颈癌HeLa细胞的抗氧化能力。

稳定表达人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A的构建及验证

为构建稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系,将实验前期构建好并实现真核表达的重组慢病毒颗粒LV-HPV58E6E7转染入HPV(–)的人宫颈癌C33A细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆,利用四唑盐比色(MTT)法检测转染后细胞的生长情况以及流式细胞术检测细胞周期,并将稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞LV-HPV58E6E7/C33A接种于裸鼠左腋下成瘤,用荧光定量PCR(q RT-PCR)、Western blot检测瘤组织中HPV58型E6E7融合基因的转录和表达。结果显示HPV58E6E7融合基因可促进C33A细胞的增殖;LV-HPV58E6E7/C33A细胞株能在裸鼠体内稳定转录及表达HPV58型E6E7融合基因。这表明我们成功建立了能稳定表达HPV58E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系LV-HPV58E6E7/C33A,为HPV58型治疗性疫苗的免疫效果检测提供了抗原细胞来源。