可注射型富血小板纤维蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管能力的体外实验研究

目的探究可注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet-rich fibrin,iPRF)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成血管分化能力的影响。方法CCK-8实验检测HUVECs增殖能力并筛选最佳浓度的可注射型富血小板纤维蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract,iPRFe);划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs迁移能力和成血管分化能力;实时定量PCR检测成血管相关基因的mRNA表达。结果0.4 mg/mL浓度的iPRFe促进HUVECs增殖效果最佳;iPRFe对HUVECs迁移和小管形成有显著的促进作用,还能明显提高血管生成素(angiogenin,ANG)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growth factor receptor A,PDGFRA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达水平。结论iPRF可以促进HUVECs增殖、迁移和成血管能力,有望成为用于牙髓再生的新材料。

纤维蛋白凝胶管状支架的制备及性能

合适的支架材料是小口径组织工程血管体外成功构建的关键之一,天然蛋白成分的纤维蛋白凝胶是理想的支架材料来源。文中首先以纤维蛋白原为原料,混合一定比例的凝血酶以及氯化钙,采取温度控制等技术步骤获得凝胶材料,并进行成胶时间、吸水性能、降解时间以及力学性能等方面的检测,采用扫描电镜观测材料的微观结构;然后,利用特定管状模具制成水凝胶管状支架,通过在支架中负载人成纤维细胞,研究纤维蛋白凝胶支架对人成纤维细胞生长的影响,判断其细胞相容性。结果显示:该制备方法获得的纤维蛋白凝胶整体外观呈乳白色,外表光滑,厚度均匀;凝胶的平均成胶时间为(172.0±4.7)s,吸水率为34.50%±1.87%,完全降解时间为7 d,杨氏模量为(2624±295)Pa,凝胶整体结构具有一定的稳定性;凝胶的微观结构呈现为多孔隙网状纤维,纤维直径为(0.41±0.03)μm,网状纤维平均孔隙大小为(47.87±9.60)μm^(2);负载人成纤维细胞后,细胞在凝胶中形态完整,分布均匀,存活情况良好。文中成果为小口径组织工程血管移植物的体外构建提供了进一步的研究借鉴。

浓缩生长因子纤维蛋白膜复合重组人表皮生长因子活性蛋白多肽修复口腔黏膜的等效损伤模型

背景:口腔黏膜的完整性和功能性对于隔绝外界刺激和抵御致病微生物的入侵有着极其重要的生物学意义。近年来,富自体浓缩生长因子与重组人表皮生长因子已然成为机体软组织损伤再生与修复领域中的两大研究热点。目的:探讨富自体浓缩生长因子联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜对于口腔黏膜等效损伤的修复价值。方法:分别制备富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜与富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜。将人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞分别接种于两种纤维蛋白膜上,组织形态学染色观察细胞增殖量。将24只BALB/c-裸鼠随机分为4组,A组为正常对照,B、C、D组在背部制作处于肌层之上的创面,C组在背部创面上覆盖富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜,D组在背部创面上覆盖复合纤维蛋白膜,术后第3周末,通过组织形态学、免疫学评价各组创面的修复效果,生物力学检测各组修复组织的抗拉伸能力。结果与结论:①苏木精-伊红、SP免疫组化及免疫荧光染色显示,人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞在两种纤维蛋白膜上生长良好,其中复合纤维蛋白膜上的细胞数量明显多于富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜;②苏木精-伊红与Masson染色显示,B组表皮层基本愈合,棘细胞层厚度减低,胶原纤维量少且排列不连续;C组角细胞层、棘细胞层、基底细胞层出现不同程度的增厚,上皮钉突减少,胶原纤维粗大密集,包绕新生血管;D组表现与C组相似,但胶原纤维、成纤维细胞及新生血管数目明显增加;③修复组织拉应力峰值大小顺序为:A组>D组>C组>B组(P<0.05);④结果表明,相较于富自体浓缩生长因子纤维蛋白膜,富自体浓缩生长因子联合重组人表皮生长因子复合纤维蛋白膜不仅可促进人牙龈成纤维细胞与人永生化角质形成细胞的附着增殖,而且可促进口腔黏膜等效损伤愈合,增加损伤局部的胶原纤维含量及抗拉伸强度,表现出更佳的修复价值。

恶性肿瘤组织中人纤维介素的表达及作用

目的研究恶性肿瘤患者病理组织中人纤维介素(human fibrinogen-like protein 2,hfgl 2)的表达及与纤维蛋白沉积的关系。方法采用免疫组化方法检测了11例结肠癌、15例宫颈癌、10例乳腺癌、9例食管癌、12例肺癌、16例胃癌患者的病理组织切片中hfgl 2及纤维蛋白的表达,分析二者的组织学关系,用RT-PCR方法检测了部分肿瘤组织与肿瘤细胞系中的hfgl 2 mRNA。结果免疫组化显示hfgl 2在上述肿瘤中均有表达,主要分布于间质浸润细胞、肿瘤实质细胞、肿瘤血管内皮细胞及细胞外基质,且在邻近有明显的纤维蛋白沉积。通过RT-PCR,在体外培养的数种肿瘤细胞系中未检出hfgl 2 mRNA,但在肿瘤组织中检出hfgl 2 mRNA表达明显高于正常组织。结论恶性肿瘤时存在hfgl 2的高表达,并且可能与肿瘤高凝状态的形成及肿瘤的演进有关。

体外重建组织工程关节软骨的实验研究

目的 用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行软骨细胞三维立体培养 ,构建人工软骨组织。方法 取 2周龄的新生兔关节软骨 ,经消化 ,将获得的软骨细胞与牛 型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合 ,制成软骨培养物并在体外培养。培养第 3周时 ,取材进行 HE、甲苯胺蓝染色和透射电镜检查。结果 体外培养 3周 ,培养物内细胞均存活 ,形成软骨陷窝 ,同源性细胞簇出现 ,并分泌软骨基质。透射电镜下可见丰富的粗面内质网和线粒体 ,及少量的高尔基复合体。结论 用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞 。

应用自体软骨细胞移植物修复关节软骨缺损

目的 通过体外扩增关节软骨细胞,构建软骨组织工程移植物,观察移植物对自体关节软骨损伤的修复作用。方法由8周龄成年兔髌骨外侧缘获取关节软骨,分离软骨细胞,体外扩增后,与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物,体外培养4 d。用于对成兔自体关节软骨损伤的移植修复。结果 成年家兔关节软骨细胞体外单层培养至第2代时开始出现去分化现象,可利用生长因子抑制去分化;该移植物的移植修复效果良好,修复后12周移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,细胞趋于柱状排列,已形成透明软骨组织。结论 利用体外扩增的方法能获得足够量表型良好的关节软骨细胞,当应用胶原一纤维蛋白为载体制备出软骨组织工程培养物后,能较好地修复自体关节软骨损伤。

富血小板纤维蛋白对人牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响

目的:研究富血小板纤维蛋白(plate-rich fibrin,PRF)体外对人牙槽骨成骨细胞(human alveolar osteoblasts,HAOB)增殖分化的影响,探讨HAOB与PRF构建临床组织工程骨的可能性。方法 :收集临床拔牙过程中的牙槽骨,采用改良酶消化法体外分离培养HAOB,根据成骨细胞形态学特征及成骨特性对所培养出的细胞进行鉴定,后加入志愿者的PRF分组培养;而后在不同的实验时间点进行细胞增殖CCK-8检测、碱性磷酸酶(ALP)定性检测、钙结节茜素红染色以及成骨相关基因RT-PCR检测。结果:HAOB具有典型的成骨细胞的形态;随时间的延长,细胞数目明显增加(P<0.05),实验组(PRF组)细胞数量明显高于对照组。实验组ALP染色较对照组颜色更深,ALP活性相对较高。经茜素红染色,实验组镜下观察形成的钙结节数量较对照组多。在第7和11天发现实验组成骨相关基因的表达量均高于对照组。结论:采用改良酶消化法分离培养的HAOB具有典型的成骨细胞生物学特性,且成分较为单一;PRF体外具有促进HAOB增殖分化的能力。

冻干人纤维蛋白黏合剂在围绝经期雌兔干眼的应用研究

目的探究冻干人纤维蛋白黏合剂通过泪道栓塞的方式对围绝经期雌兔干眼症的预防和治疗效果。方法选取72只经抗感染处理后剪除第三眼睑的雌兔,制作围绝经期雌兔干眼症模型,手术完成后将其随机分为6组(每组12只):术后无处理组(A组)、PBS预防组(B组)、冻干人纤维蛋白预防组(C组)、造模后无处理组(造模时间:术后2个月,D组)、PBS治疗组(E组)、冻干人纤维蛋白治疗组(F组),并于注射前及注射后2周、4周及6周行Schirmer实验(SIT)检查、角膜荧光素(fluorescein,FL)染色及角膜共聚焦显微镜检查。结果D、E、F三组不同时间点间的FL评分和SIT值有一定差别(F=27.346、10.608,P=0.000、0.001);三组间FL评分和SIT值有一定差别(F=7.579、6.786,P=0.002、0.007);三组的FL评分和SIT值的变化趋势有明显差别(F=44.897、3.424,P=0.000、0.045)。D组、E组、F组在处理2周、4周、6周后,F组FL评分和SIT值较D组明显好转,差异有统计学意义(t=2.906、3.654、4.504,P=0.022、0.017、0.013;t=4.573、5.759、7.231,P=0.032、0.019、0.008);E组、F组FL评分和SIT值在处理后相比,差异有统计学意义(t=2.776、4.124、5.324,P=0.032、0.026、0.017;t=1.969、3.122、4.324,P=0.038、0.023、0.009)。A、B、C三组注射6周后上皮基底细胞(F=17.306,P=0.002)和炎症细胞密度(F=34.024,P=0.000)比较,D、E、F三组上皮基底细胞(F=3.749,P=0.042)和炎症细胞密度(F=8.806,P=0.005)比较,均有统计学差异。结论通过冻干人纤维蛋白黏合剂进行泪道栓塞对于干眼症的预防和治疗均有显著疗效。

富血小板纤维蛋白对人牙周膜细胞增殖及成骨能力的影响

目的:检测富血小板纤维蛋白提取液(PRFe)对人牙周膜细胞(h PDLCs)增殖及成骨分化能力的影响.方法:组织块法分离培养h PDLCs,免疫组化鉴定来源;Choukroun法制取PRFe;MTT法检测不同体积分数的PRFe对h PDLCs增殖活性的影响以确定最适宜体积分数的PRFe.实验分为空白对照组和PRFe组.碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性;茜素红染色观察细胞矿化功能;Western Blotting检测细胞中成骨蛋白BMP2和Runx2的表达.结果:体积分数为50%的PRFe吸光度值高于其他实验组(P<0.05).选择体积分数为50%的PRFe用于后续实验,ALP活性检测、茜素红染色结果显示PRFe组的检测指标随着时间延长上升幅度均显著大于空白对照组,具有统计学差异(P<0.05),PRFe组ALP活性与矿化结节积分光密度值于各时间点均高于空白对照组,具有统计学差异(P<0.05).Western Blotting结果显示PRFe组成骨蛋白表达强于对照组,具有统计学差异(P<0.05).结论:PRFe具有促进体外h PDLCs增殖以及成骨分化的作用.

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。

纤维蛋白胶在眼科手术中的应用

缝线缝合是目前眼部切口修复的标准治疗方法,缝线缝合的缺陷促使人们去探索发展无缝线手术技术。组织黏合剂具有组织黏附力,有止血、封闭和黏合切口的作用。其中纤维蛋白胶具有很好的生物相容性和可以完全生物降解等独特优点,是一种安全、有效的缝线替代物,也是一种很有潜力的生物组织黏合剂。目前,在很多眼科手术中得到应用。但其也具有黏合强度不高,费用较高的不足。

富血小板纤维蛋白提取液对经TNF-α刺激下人牙周膜细胞的影响

目的:检测富血小板纤维蛋白提取液(PRFe)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激下的人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化能力的影响。方法:组织块法分离培养hPDLCs,免疫组化鉴定其来源;Choukroun法制取PRFe;实验分为空白对照组、TNF-α(10 ng/ml)组、PRFe组和PRFe+TNF-α(10 ng/ml)组。碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性;茜素红染色观察细胞矿化功能;Western blotting检测Runx2、Osterix蛋白含量。结果:ALP活性检测、茜素红染色和Western blotting结果显示TNF-α组各项指标均低于空白对照组(P<0.05),PRFe组各项指标均高于空白对照组(P<0.05),PRFe+TNF-α组各项指标均高于TNF-α组(P<0.05),PRFe组各项指标均高于PRFe+TNF-α组(P<0.05)。结论:PRFe可促进经TNF-α刺激的hPDLCs成骨分化。

纤维蛋白封闭剂对人牙髓细胞生长的影响

目的:观察fibrin sealant（FS）对人牙髓细胞贴壁率、生长曲线、增殖以及碱性磷酸酶活性的影响。方法:体外培养人牙髓细胞并鉴定,采用细胞记数法计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线;采用MTT法测定细胞增殖;采用碱性磷酸酶试剂盒测定碱性磷酸酶活性。结果:FS组细胞的早期贴壁率明显高于对照组。FS组的细胞贴壁率在2h时是对照组的4.6倍,8h时FS组细胞的贴壁率超过100％（102.6％）,而对照组在24h超过100％（103％）。进入对数生长期后,FS组和对照组两条曲线曲度大致相似,实验组与对照组的MTT和ALP的A值无显著差异。结论:FS具有良好的生物相容性,有利于体外培养的牙髓细胞的早期贴壁和存活,但对细胞增殖速度及细胞分化无显著影响。

人黑色素瘤细胞分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化

本文报道了培养的人黑色素瘤细胞分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化方法。Bowes株人黑色素瘤细胞的分泌产物,经CM-Sephadex C--50层析,赖氨酸-Sepharose 4B,苯甲眯-sepharose 4B亲和层析后,即可得到纯化470倍的蛋白纯品。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为均一单带,测得其分子量约为72kD。纯化的t-PA与尿激酶相比较,发现前者有更高亲和纤维蛋白的能力。

组织工程化肌腱种子细胞的研究概况

随着生命科学和材料科学的发展,组织工程学(TE)已逢勃兴起并取得可喜的成绩．以往在肌腱损伤或缺失手术修复后易发生粘连或术后断裂,导致功能障碍．TE肌腱是最理想的肌腱替代物,目前最主要的难题是缺乏理想的种子细胞,可作为种子细胞应用的有:胚胎干细胞和成体干细胞,其中以自体肌腱细胞效果最好,但由于来源困难,不易广泛应用．目前以人胚胎肌腱细胞作为TE肌腱的种子细胞前景最好．

纤维蛋白(原)及其降解产物对共培养人脐静脉内皮细胞的细胞间黏附分子-1表达的影响

目的探讨纤维蛋白原(Fg)、纤维蛋白(Fb)及其降解产物(FDPs)对人脐静脉内皮细胞(HU-VECs)/兔平滑肌细胞(SMCs)共培养模型中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法建立原代HU-VECS与兔SMC共培养体系,根据干预物及其浓度的不同分为Fg、Fb、FDPs组及相应的0 mg/ml、0.5 mg/ml、3.0 mg/ml和6.0 mg/ml亚组。应用核因子B抑制蛋白(I-B)拮抗剂BAY 11-7082、蛋白激酶C(PKC)拮抗剂Staurosporine分别对0.5 mg/ml、3.0 mg/ml和6.0 mg/ml亚组进行干预。采用反转录(RT)-PCR法检测HU-VECS内ICAM-1 mRNA水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液的ICAM-1蛋白含量。结果 Fg 3.0mg/ml和6.0 mg/ml亚组ICAM-1 mRNA水平和蛋白含量显著高于0 mg/ml亚组及相应浓度Fg+BAY 11-7082亚组(均P<0.05);Fg 3.0 mg/ml亚组ICAM-1 mRNA水平和蛋白含量显著高于3.0 mg/ml+Staurosporine亚组(均P<0.05)。Fb 6.0 mg/ml亚组ICAM-1 mRNA水平显著高于0 mg/ml、6.0 mg/ml+BAY11-7082和6.0 mg/ml+Staurosporine亚组(均P<0.05),但Fb 6.0 mg/ml亚组ICAM-1蛋白含量显著高于0 mg/ml亚组(P<0.05)。FDPs 6.0 mg/ml亚组ICAM-1 mRNA水平和蛋白含量显著高于0 mg/ml、相应浓度BAY11-7082和Staurosporine亚组(均P<0.05)。结论中、高浓度Fg、Fb、FDPs能上调血管内皮细胞ICAM-1的表达。

纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘形成相关蛋白表达的影响

目的:探讨纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞髓鞘相关蛋白表达的影响。方法:将体外培养的成人鼻粘膜嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架,用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照底物,培养14天后用扫描电镜观察细胞的形态学变化并对细胞内髓鞘形成相关蛋白2,3-环核苷3-磷酸二酯酶(2′,3′cyclic nucleotide 3′phosphodiesterase,CNPase)和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)进行免疫荧光染色定位和免疫印迹半定量测定,分析纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞CNPase和MBP表达的影响。结果:人嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架后,其形态为长条带状,细胞成束排列,方向一致。细胞内CNPase和MBP表达水平明显高于对照组。结论:纤维蛋白支架与人嗅鞘细胞具有很好的生物相容性并可促进细胞表达髓鞘相关蛋白CNPase和MBP;将该组织工程支架用于移植治疗脊髓损伤,有利于再生神经纤维的髓鞘形成。

SZ-63单链抗体的基因构建、表达及免疫性研究

目的 基因构建与表达SZ 63单链抗体 (SZ 63scFv) ,降低单克隆抗体对人体的免疫源性。方法 运用基因工程手段通过一段小分子连接肽 (Gly4 Ser) 3将SZ 63抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因连接 ,构建成pET2 2b 63scFv表达载体 ,并导入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) plys中进行表达 ,同时进行表达特性的研究。 结果 pET2 2b 63scFv在BL2 1(DE3 ) plys中经IPTG诱导后 ,SZ 63scFv以包涵体形式存在 ,经复性处理后具有与纤维蛋白D 二聚体结合的活性 ,其表达量占菌体总蛋白的 18% ,SZ 63scFv具有 13mg/ g湿菌的表达量。 结论 成功地获得了SZ

纤维蛋白胶为载体构建人羊膜上皮细胞植片的实验研究

目的:探讨利用纤维蛋白胶作为支架构建组织工程人羊膜上皮细胞(HAECs)植片重建眼表的可行性。方法:取足月剖宫产胎盘羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获得HAECs。在体外构建的纤维蛋白胶片上培养HAECs,细胞融合成片后,利用气液界面复层化,采用倒置显微镜、组织切片、HE染色、细胞角蛋白免疫组织化学染色和扫描电子显微镜观察HAECs的生长情况。结果:HAECs在纤维蛋白胶表面生长良好,细胞呈圆形或多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观,扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛,细胞广谱角蛋白单克隆抗体染色阳性。细胞有复层生长趋势,植片较为透明。结论:以纤维蛋白胶为载体构建组织工程人HAECs植片,具有眼表重建的潜在运用价值。