人胎儿脑的一个cDNA编码序列及其蛋白质预测

用 m RNA差异显示 PCR技术 ,从人 1 8周、2 2周胎儿脑和肝肾组织的 m RNA逆转录产物得到一些特异性显示的片段 .其中一个随机片段 GC1 0 2作为探针 ,从本实验室构建的 1 8周胎儿脑c DNA基因文库进行杂交筛选 ,得到一个阳性克隆λ gt1 0 /GC1 0 2 .该克隆内插入的 c DNA片段长2 .9kb,经过 DNA测序 ,显示具有一个开放阅读框架 ,编码 1 37个氨基酸的肽链 .用蛋白质结构的建模软件预测了该肽链的立体结构初步模型 .

人16周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

本文从 16周的胎儿脑中抽提总 m RNA,经过一系列酶促反应后合成 c DNA,分级分离柱除去小片段 DNA后克隆到λgt10载体中 ,转染宿主菌 C60 0 hfl,文库包装效率为 4 .2× 10 6pfu/μg,得到的原始克隆数为 2 .1× 10 6,c DNA插入片段平均大于 1.2 kpb.根据已知序列设计引物 ,从这个 c DNA文库中扩增出血管内皮生长因子 ( VEGF)的全长 c

人18周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

许多脑基因的特异性表达对人脑的发育、分化有着重要的作用．为了研究这些基因的结构和功能，构建了一个人18周胎儿脑cDNA文库．抽提总mRNA后，经过一系列的酶促反应合成cDNA．分级分离柱除去小片段后克隆到λgt10载体中．转染宿主菌C600hfl后文库包装效率为4．6×106pfu／μg，cDNA平均插入片段大于1．2kbp．根据已知序列设计引物，从cDNA文库中扩增出神经生长因子（NGF）的全长编码基因．

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。

自噬基因APG5基因结构的生物信息学分析

利用生物信息学手段对一种与人类细胞凋亡有关的基因———自噬基因 (Autophagy 5 ,简称APG5 )的基因组全序列进行拼接和基因结构分析 ,同时该基因的一个新的可变性剪切变异体 (APG5 β)被首次证实及报道。利用PCR技术从人胚脑cDNA文库和B细胞cDNA文库中调取APG5基因 ,装入绿色荧光蛋白pEGFP C1表达载体 ,测序确定其核苷酸序列 ,进行数据库搜索。该基因组全序列分散在核酸序列数据库GenBank的几个不同序列条目中。将相关克隆的基因组序列做相似性比对 ,用DOTPLOT方法确定其相互位置关系 ,并进行序列拼接 ,得到全长基因。利用GenScan、Genefinder等基因识别软件确定其内含子、外显子、转录起始位点、加尾信号等 ,分析其基因结构 ,在此基础上进一步分析其cDNA中外显子数目和排列顺序 ,证实了从B细胞cDNA文库中克隆所得的APG5为一种可变性剪切变异体。利用生物信息学工具 ,成功地拼接出全长为 1 5 0kb人类APG5基因基因组全序列 ,确定其有 8个外显子。根据剪切位点的特性找出其在序列中的位置 ,分别计算出内含子、外显子的长度 ,首次证实并报道APG5 β是第 3外显子缺失的可变性剪切变异体。将验证确实的APG5 β转染至人肝细胞株和HeLa细胞株 ,在共聚焦激光显微镜下可观察到其在细胞凋亡时的特异表达。

人脑神经生长因子基因的体外扩增

作者设计并合成一对特异性DNA引物,采取聚合酶链反应技术,分别从人脑cDNA文库和人脑基因组DNA中成功地制备了神经生长因子β亚基(β-NGF)基因片段,为该基因表达载体的构建奠定了基础。

酵母双杂交技术筛选人巨细胞病毒UL131A的相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL131A编码蛋白相互作用的蛋白.方法:将成功构建的酵母诱饵表达载体pGB-KT7-UL131A转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL131A的酵母细胞中,筛选与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL131A,并将其与人胎脑cDNA文库共转化到酵母细胞AH109中,最终确认有23种人胎脑文库蛋白与HCMV UL131A编码蛋白相互作用,其中一种与Thy-1蛋白高度同源,其同源性高达99%.结论:成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.

初步筛选心血管相关基因——表达序列片段测定法

目的从正常人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库中，用ＤＮＡ自动测序的方法筛选心血管相关基因。方法（１）人胚胎心ｃＤＮＡ文库的构建；（２）挑取有目的基因片段插入的噬菌斑，选用正向Ｔ３和反向Ｔ７引物做ＰＣＲ扩增；（３）直接使用其ＰＣＲ产物做ＤＮＡ测序模板，用荧光标记的Ｔ３Ｂ引物做再次ＰＣＲ扩增；（４）用ＤＮＡ测序仪（ｐｈａｒｍａｃｉａ）测定基因表达序列片段（ＥＳＴｓ）；（５）将所获得的ＥＳＴｓ输入Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库做同源序列分析。结果（１）所构建的人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库的库容量为１×１０９克隆，平均目的基因片段１．２～１．５ｋｂ，ＰＣＲ产物阳性克隆检出率高达７０％以上，用６％尿素－聚丙烯酰胺凝胶电泳５ｈ，可测ｃＤＮＡ序列片段２１０～５５０ｂｐ，平均３００ｂｐ；（２）在所测３１３２个克隆的ＥＳＴｓ中，新ＥＳＴｓ为４７．４％，已知序列片段为４４．１％。结论利用人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库测定ＥＳＴｓ是筛选心血管基因的有效方法；构建高质量的ｃＤＮＡ文库是成功测定ＥＳＴｓ的保证。