凝血酶诱导人肺成纤维细胞释放单核细胞趋化蛋白-1

目的：研究凝血酶对人肺成纤维细胞（HFL-1）释放单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的调节作用。方法：HFL-1分别培养于96孔培养板各孔内，不同浓度（0．001-300nmol／L）凝血酶诱导2、6、9、12、24h后，收集上清液并用ELISA法检测其MCP-1浓度。结果：凝血酶可诱导HFL-1释放MCP-1，其最高释放量是基础分泌量的近17倍。凝血酶诱导的HFL-1释放MCP-1呈浓度和时间相关性。结论：凝血酶可诱导HFL-1表达MCP-1。

蛋白酶活化受体1介导人胚肺成纤维细胞释放单核细胞趋化蛋白-1

目的:研究蛋白酶活化受体1(PAR1)对凝血酶诱导人胚肺成纤维细胞(HFL-1)释放单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的调节作用。方法:HFL-1用PAR1激动剂凝血酶、PAR1活性肽SFLLR和反活性肽RLLFS进行诱导,并用PAR1阻断剂SCH79797进行阻断后用凝血酶和SFLLR刺激;用ELISA检测MCP-1浓度。结果:凝血酶及SFLLR可引起HFL-1释放MCP-1,而RLLFS不能引起MCP-1的释放增加;SCH79797可阻断凝血酶及SFLLR诱导HFL-1释放MCP-1。结论:PAR1介导凝血酶诱导的HFL-1细胞释放MCP-1。

胸腺细胞分化抗原-1DNA甲基化在硫酸铍致人胚肺成纤维细胞纤维化中作用研究

目的通过观察硫酸铍刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)所致胸腺细胞分化抗原-1(Thy-1)DNA甲基化改变情况,探讨Thy-1在硫酸铍致肺纤维化中的作用。方法建立离体MRC-5细胞培养实验模型,以终浓度分别为1.0、10.0和100.0μmol/L的硫酸铍染毒(设为低、中、高剂量组),对照组不作染毒处理;另设甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(AZC)干预组(予终浓度为10.0μmol/L硫酸铍和10.0μmol/L AZC处理)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)干预组(予终浓度为10.0μmol/L硫酸铍和0.5μmol/L TSA处理)。分别在染毒24、48和72 h后收集细胞,采用实时定量式聚合酶链式反应检测胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Thy-1的mRNA相对表达水平,巢式降落式甲基化特异性聚合酶链式反应检测Thy-1 DNA甲基化水平。结果在24 h时间点,MRC-5细胞中胶原蛋白ⅢmRNA相对表达水平呈随染毒剂量增加而增加的趋势(P<0.05);在48和72 h时间点,MRC-5细胞中胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA相对表达水平均呈随染毒剂量增加而增加的趋势(P<0.05);3个剂量组MRC-5细胞上述3个指标均呈随着染毒时间的增加而增加趋势(P<0.05)。3个剂量组MRC-5细胞Thy-1 mRNA相对表达水平均低于对照组(P<0.05),高剂量组MRC-5细胞Thy-1 mRNA相对表达水平低于低剂量组(P<0.05)。中、高剂量组Thy-1 DNA甲基化水平均高于对照组(P<0.05),3个剂量组Thy-1 DNA甲基化水平呈随染毒剂量增加而增加趋势(P<0.05)。2个干预组MRC-5细胞Thy-1 DNA甲基化水平均高于对照组(P<0.05),但与中剂量组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论硫酸铍刺激可导致MRC-5细胞纤维化的发生;该过程中Thy-1 DNA甲基化程度升高,Thy-1 mRNA表达水平降低,可能是硫酸铍致肺纤维化的重要机制之一。

固本防哮饮含药血清对IL-4刺激的人胚肺成纤维细胞中ADAM33、ETS1表达的影响

目的:研究固本防哮饮含药血清对白细胞介素-4(IL-4)刺激的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中解整合素金属蛋白酶(ADAM)33和E26转录因子(ETS)1表达的影响,探讨其可能的抗哮喘作用机制。方法:制备固本防哮饮含药血清,以IL-4刺激MRC-5细胞,采用固本防哮饮含药血清进行干预,24h后收集细胞,Real-time RT-PCR法检测各组细胞中ADAM33、ETS1 mRNA的表达;Western Blot法检测各组细胞中ADAM33、ETS1蛋白的表达;免疫荧光技术检测ADAM33和ETS1在细胞亚结构的定位及相对表达。结果:固本防哮饮含药血清能显著降低IL-4刺激的MRC-5细胞中ADAM33、ETS1 mRNA的高表达(P<0.01),且孟鲁司特钠含药血清对ADAM33 mRNA的下调作用显著优于固本防哮饮组(P<0.01),固本防哮饮含药血清对ETS1 mRNA的下调作用优于孟鲁司特钠组(P<0.05)。固本防哮饮含药血清能降低IL-4刺激的MRC-5细胞中ADAM33蛋白的高表达(P<0.05)和ETS1蛋白的高表达(P<0.01)。ADAM33、ETS1蛋白主要在细胞膜和细胞质中表达,而固本防哮饮含药血清能显著降低IL-4刺激的MRC-5细胞中ADAM33、ETS1平均荧光强度(P<0.01)。结论:固本防哮饮可通过调控ADAM33、ETS1的表达,减轻气道高反应性以及气道重塑,防治支气管哮喘。

雷帕霉素诱导自噬抑制大鼠尿道损伤后纤维化的作用机制研究

目的探究雷帕霉素(Rapa)对大鼠尿道狭窄形成和成纤维细胞的影响及其作用机制。方法构建大鼠尿道狭窄模型(SD雄性大鼠,体质量250~300 g),采用随机数字表法分为阴性对照组、阳性对照组和Rapa组,每组10只。术后14 d取大鼠尿道组织,行HE染色观察尿道组织形态学变化,Masson染色检测胶原变化;免疫组化法观察α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。将HLF-1细胞分为对照组,Rapa组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)+Rapa组。应用transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况,Western blotting检测LC3的表达。结果HE染色发现Rapa组大鼠尿道组织狭窄程度较阳性对照组明显减轻,Masson及免疫组化染色结果显示,阳性对照组和Rapa组大鼠损伤尿道组织中胶原和α-SMA表达均较阴性对照组大鼠增加,但Rapa组胶原和α-SMA表达显著低于阳性对照组。与对照组相比,Rapa组HLF-1细胞迁移、侵袭能力逐渐减弱,呈剂量依赖关系(均P<0.05),而加入3-MA干预后,Rapa对HLF-1迁移、侵袭和能力的抑制作用减弱(均P<0.05)。流式细胞术及Western blotting结果显示,与对照组相比,Rapa组细胞凋亡明显增加(均P<0.05),且细胞LC3表达呈剂量依赖性增多(均P<0.05)。结论雷帕霉素可以缓解大鼠尿道组织损伤后纤维化,并抑制HLF-1细胞迁移和侵袭能力,诱导HLF-1细胞的凋亡,其效应可能是通过诱导细胞自噬来实现的。