复方藤梨汤含药血清对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的探究复方藤梨汤含药血清对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响。方法将24只雄性SD大鼠分为对照组和低、中、高剂量组[复方藤梨汤6、12、24g/(kg·d)],每组6只,制备含药血清处理人脑胶质瘤U251细胞。采用CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布与细胞凋亡,定量聚合酶链反应检测原癌基因C-myc、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因表达,Western blot法检测细胞凋亡蛋白[B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8]以及β-连环蛋白(β-catenin)、上皮性黏附蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达。结果选取体积分数10%的含药血清为最终剂量。与对照组比较,低、中、高剂量组细胞活力、克隆形成数、C-myc mRNA、CyclinD1 mRNA、Vimentin表达水平降低,处于S期细胞比例、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3表达水平升高(P<0.05);低、高剂量组G1期细胞比例降低(P<0.05);中、高剂量组G2期细胞比例、β-catenin表达水平降低,Caspase-8和E-cadherin表达水平升高(P<0.05);高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论复方藤梨汤含药血清可促使人脑胶质瘤U251细胞阻滞于S期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过调节β-catenin、E-cadherin和Vimentin表达抑制上皮间质转化。

姜黄素通过改变FAK表达和激活caspase诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡

目的研究姜黄素诱导U251细胞凋亡机制。方法20～100μmol·L^-1姜黄素分别处理U251细胞24h后，MTT法测定姜黄素对U251细胞的细胞抑制作用及各种caspase抑制剂对姜黄素作用的影响；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；透射电镜观察细胞形态学变化；用免疫细胞化学分析姜黄素对FAK（focal adhesion kinase，粘着斑激酶）蛋白质表达的影响；荧光分光光度法检测caspase-3活性的改变。结果姜黄素明显抑制U251细胞的增殖；诱导U251细胞凋亡；FAK蛋白表达减少；easpase-3活性增强，各种caspase抑制剂可抑制姜黄素诱导的U251细胞凋亡。结论姜黄素通过抑制FAK蛋白的表达和激活caspase途径可诱导U251细胞凋亡。

替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的观察替莫唑胺对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法取对数生长期U251细胞,分别加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺,空白对照组不加替莫唑胺,分别培养24、48、72 h,MTT实验观察细胞增殖情况;取对数生长期U251细胞,加入0.06 g/L替莫唑胺(0.06 g/L替莫唑胺组),细胞培养48 h后,用流式细胞技术测算细胞凋亡率,RT-PCR法、Western blotting法检测存活素(Survivin)mRNA、蛋白。结果随着替莫唑胺浓度增加及作用时间延长,U251细胞增殖抑制率越高。0.06 g/L替莫唑胺组细胞凋亡率为22.6%±2.3%,对照组为3.3%±1.1%,两组比较,P<0.05;0.06 g/L替莫唑胺组Survivin mRNA相对表达量为0.65±0.11,对照组为0.96±0.15,两组比较,P<0.05;0.06 g/L替莫唑胺组Survivin蛋白相对表达量为0.25±0.03,对照组为0.49±0.04,两组比较,P<0.05。结论替莫唑胺能有效抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制Survivin表达有关。

铅暴露U251细胞差异表达基因分析

为研究体外培养的人神经胶质瘤U251细胞(human U251glioma cells)铅暴露后基因表达的改变,分析脑中差异表达基因,探讨铅暴露与神经毒性之间的关系,使用浓度为400μg·mL-1乙酸铅暴露U251细胞8h和24h,设置空白对照,提取RNA.应用基因芯片方法寻找差异表达基因,芯片扫描结果经归一化处理,设定Ratio值<0.5或≥2.0为表达有差异基因.结果表明铅暴露U251细胞导致2840条基因差异表达,暴露8h和24h皆上调表达的基因有92条,皆下调表达的基因有85条,其中132条基因在脑中表达;通过与数据库资料比对,109条基因与其在脑表达情况一致,23条基因不一致(15条基因高表达,8条基因低表达).从实验结果可以看出铅暴露能够导致U251细胞基因表达改变,抑制细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,负调控T细胞免疫活性.导致与神经发生、细胞骨架形成相关基因表达下调,神经保护能力下降,铅暴露可能与神经变性疾病及退行性疾病发生有关.

FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞凋亡的影响

目的:研究FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤U251细胞凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测35例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FUBP1 mRNA的表达。设计并合成FUBP1基因特异性的siRNA,转染U251细胞。转染后,western blot检测转染后FUBP1蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果:与癌旁组织相比,FUBP1 mRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U251细胞中的FUBP1蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论:FUBP1基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。

铅暴露U251细胞差异表达基因及相关通路

为探讨铅对体外培养的人神经胶质瘤U251细胞(human U251glioma cells,U251)暴露后基因表达的变化以及相关基因通路,选用乙酸铅暴露U251细胞.细胞在乙酸铅中暴露8h和24h后提取RNA,使用cDNA芯片分析基因表达情况,芯片扫描结果经归一化处理,设定Ratio值<0.5或≥2.0为表达有差异基因.结果表明,铅暴露U251细胞导致2840条基因差异表达,使用KEGG和BioCarta数据库分析代表性基因网络.结果发现,铅暴露U251细胞导致大量基因差异表达,涉及多个代谢及信号通路,与神经组织相关的主要信号通路有Ca2+信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路等,还涉及配体-受体、细胞因子相互作用等.这些通路相互联结,构成复杂的网络系统,调控细胞的生物学功能.

HCMV感染对下调ATF5的人胶质瘤U251细胞干性的影响

研究HCMV感染对下调ATF5的U251细胞干性标记物CD133的表达、细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。采用荧光定量PCR及Western-blot方法检测HCMV(MOI=1)感染的U251细胞IE、CD133基因及蛋白表达水平的变化,结果表明,随IE表达量的增加U251细胞中CD133表达量显著增加;成功构建沉默ATF5细胞系siATF5-U251,HCMV感染siATF5-U251细胞后使细胞增殖活性减弱,克隆形成率降低;荧光定量PCR及Western-blot检测HCMV感染显著抑制了siATF5-U251细胞内CD133的表达。因此,抑制ATF5的表达可成为恶性胶质瘤预防和治疗的新的作用靶点。

纳米Fe_3O_4/CD133Ab复合物对胶质瘤U251细胞放疗增敏作用的实验研究

目的探讨纳米Fe3O4/CD133Ab复合物对脑胶质瘤U251细胞的放射增敏作用。方法细胞免疫组化法检测脑胶质瘤U251细胞CD133的表达情况;流式细胞分选获得U251-CD133+细胞;MTT法观察纳米Fe3O4/CD133Ab复合物和CD133Ab分别对脑胶质瘤细胞U251及U251-CD133+的细胞毒作用;克隆形成抑制实验检测纳米Fe3O4/CD133Ab复合物和CD133Ab对脑胶质瘤U251细胞放射增敏的影响。结果脑胶质瘤U251细胞中有CD133分子阳性表达并可以分选出CD133阳性表达细胞;在0.0488～25μg/ml范围内,纳米Fe3O4/CD133Ab复合物作用于脑胶质瘤U251及U251-CD133+细胞24h的细胞毒性呈明显剂量依赖性,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P>0.05)。纳米Fe3O4/CD133Ab复合物对脑胶质瘤U251和U251-CD133+细胞的增殖抑制率最高值分别为59.46%和56.66%,IC50分别为11.84μg/ml和12.06μg/ml。纳米Fe3O4/CD133Ab复合物+照射组与CD133Ab+照射组比较,细胞存活分数差异有统计学意义(P<0.05),在照射4Gy以上时,随X射线剂量增加而放射敏感性增强。结论纳米Fe3O4/CD133Ab复合物对脑胶质瘤细胞U251和U251-CD133+有细胞毒作用,并且对U251细胞有放射增敏作用。

重组改构人TNF-α联合顺铂对人胶质瘤U251细胞的生长抑制作用

目的:观察重组改构人肿瘤坏死因子α(rmhTNF-α)联合顺铂(CDDP)对人胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法:人胶质瘤U-251细胞分为对照组(不加药);T组:加入rmhTNF-α(20μg/L);C组:加入CDDP(2mg/L);T+C组:加入rmhTNF-α(20μg/L)及CDDP(2mg/L)。MTT法检测细胞生长抑制率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化情况,用免疫组织化学方法检测细胞PCNA、Bcl-2、P170蛋白的表达情况。结果:T组、C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05),T+C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于其他各组(P<0.05)。T组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达低于对照组(P<0.05),T+C组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达均明显低于其他各组(P<0.05),对照组、T组及T+C组P170蛋白表达低于C组(P<0.05)。结论:rmhTNF-α能抑制人胶质瘤细胞生长,其机制与诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖活性有关,且rmhTNF-α与CDDP联用有协同增效作用。

miR-200b通过靶向CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的研究hsa-miR-200b对人U251胶质瘤细胞增殖的影响及相关作用机制。方法将miR-200b过表达和表达沉默质粒分别稳定转染至胶质瘤U251细胞,qRT-PCR验证转染效率,CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化,qRTPCR以及Western blot方法检测的CRKL的m RNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点。将CRKL过表达和表达沉默质粒载体分别稳定转染至U251胶质瘤细胞,使用CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化。分别建立miR-200b和CRKL的稳定双转染U251细胞系,使用CCK-8法检测对各组细胞增殖水平的变化。结果与对照组相比,miR-200b过表达显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖并且抑制CRKL在U251胶质瘤细胞的m RNA和蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证了miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点;CRKL过表达显著增强胶质瘤U251细胞增殖能力;CRKL过表达有效阻断了miR-200b抑制胶质瘤U251细胞增殖的作用。结论 miR-200b能够通过靶向下调CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖。

凤尾草总黄酮抑制U251细胞迁移的体外研究

目的:观察凤尾草总黄酮对人脑胶质瘤U251细胞体外迁移能力的影响。方法:Transwell迁移实验观察不同浓度凤尾草总黄酮(5、10g/L)对人脑胶质瘤U251细胞迁移能力的影响,Western Blot法检测U251细胞IL-6蛋白的表达水平。结果:不同剂量凤尾草总黄酮可抑制脑胶质瘤U251细胞的体外迁移能力,并下调U251细胞IL-6的表达水平。结论:凤尾草总黄酮抑制人脑胶质瘤U251细胞迁移能力的作用可能与其抑制IL-6蛋白的表达水平有关。

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的探讨RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响。方法分别构建3种靶向c-Met基因的短发卡RNA(sh RNA)序列,以脂质体转染的方式导入人脑胶质瘤U251细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。采用PCR和Western blot检测c-Met-sh RNA转染后U251细胞c-Met的表达情况,以筛选出可有效沉默c-Met基因的sh RNA。c-Met基因沉默后,采用MTT法和流式细胞术检测U521细胞增殖情况,采用Transwell法和细胞划痕实验检测U251细胞侵袭和迁移情况,采用裸鼠荷瘤实验研究U251细胞体内成瘤性。结果成功构建可有效沉默c-Met基因的c-Met-sh RNA1。沉默c-Met后,c-Met m RNA以及蛋白的表达均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);而且可明显抑制U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力。

干扰MGMT的人胶质瘤U251细胞对替莫唑胺的敏感性变化

目的观察干扰O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的人胶质瘤U251细胞对替莫唑胺(TMZ)的敏感性变化。方法培养人胶质瘤U251细胞,将U251细胞经16 mg/L替莫唑胺处理后分别转染si RNA-MGMT与siRNA-control,转染si RNA-MGMT质粒组为观察组,转染si RNA-control质粒组为对照组,不转染任何序列组为单药组,共培养48 h后收获细胞。qRT-PCR法检测三组细胞中MGMT的mRNA表达改变,MTT法观察各组U251细胞增殖能力,Transwell实验检测各组U251细胞侵袭能力。结果 qRT-PCR检测结果显示,观察组U251细胞中MGMT的mRNA表达量为(0.285±0.031),与对照组(1.104±0.096)和单药组(0.974±0.083)比较均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),而对照组与单药组比较差异无统计学意义(P>0.05);MTT检测结果显示,观察组U251细胞的OD值为(0.392±0.014),与对照组(0.561±0.021)和单药组(0.530±0.019)比较均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),而对照组与单药组比较差异无统计学意义(P>0.05);Transwell检测结果显示,观察组U251细胞穿过基质胶的数量为(64.27±7.04)个,与对照组[(128.14±14.37)个]和单药组[(119.63±10.92)个]比较均明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),而对照组与单药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论干扰MGMT的人胶质瘤U251细胞对替莫唑胺的敏感性增强。

葛根素对胶质瘤细胞迁移侵袭能力影响研究

目的:探讨葛根素对人胶质瘤细胞U251的迁移、侵袭能力的影响。方法:体外培养U251细胞,加入佛波脂诱导,明胶酶谱法和Transwell小室分别观察不同浓度葛根素对其MMP表达水平及迁移侵袭能力的影响。结果:与对照组相比,葛根素显著降低U251细胞的MMP-2、MMP-3、MMP-9酶活性及迁移、侵袭能力,且呈一定量效关系。结论:通过抑制MMP酶活性,葛根素可有效抑制人胶质瘤细胞U251的迁移侵袭。

胶质瘤中MicroRNA-374的表达及其临床意义

目的研究人脑胶质瘤组织中微小RNA-374(microRNA-374,miR-374)的表达及其与临床病理特征之间的关系,探讨其在胶质瘤患者中的临床意义。方法采用RT-PCR法检测85例胶质瘤和30例正常脑组织中的miR-374表达;Kaplan-Meier法分析胶质瘤患者的总生存期;观察慢病毒过表达miR-374载体转染U251和U87细胞株后对肿瘤细胞增殖的影响。结果胶质瘤组织中miR-374的表达明显下调;miR-374的表达与WHO分级(P=0.008)、Karnofsky评分(KPS)(P=0.021)和生存时间(P=0.01)显著相关;Kaplan-Meier分析结果表明,miR-374低表达与高表达患者总生存期(P<0.01)的差异有统计学意义,miR-374低表达的患者预后较差。多因素分析显示胶质瘤中miR-374的差异表达是预测胶质瘤患者预后的独立危险因素(HR:5.75,95%CI:3.56-6.93,P=0.005)。体外实验表明,过表达miR-374可以显著抑制胶质瘤细胞的增殖。结论 miR-374在胶质瘤中是低表达的,与胶质瘤患者预后显著相关;miR-374高表达可抑制胶质瘤细胞的增殖。

HCMV IE1和pp65在人神经胶质瘤U_(251)细胞中的时序表达

目的:研究人神经胶质瘤U251细胞对人巨细病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的容许性,并探讨病毒蛋白IE1及pp65的时序表达特点。方法:HCMV感染U251细胞,以透射电镜观察U251细胞的形态学改变,以PCR方法检测HCMV核酸,于不同的时间点分别用抗蛋白IE1及蛋白pp65单克隆抗体进行免疫细胞化学染色,检测IE1及pp65的表达水平。结果:受染的U251细胞出现了明显的形态学改变,并用PCR方法检测到了HCMV核酸。免疫细胞化学染色表明,蛋白IE1在感染后30min～2h无表达,4h开始表达,14h达高峰,随后下降;蛋白pp65在感染后1h为入侵型pp65,4～96h一直呈低水平表达,至120h表达急剧升高。结论:U251细胞是HCMV的容许细胞,HCMV在其中的表达具有时序性,但是其时序表达较在人成纤维细胞中延迟。

FUBP1与c-myc在脑胶质瘤中的表达及调控关系

目的:探讨FUBP1与c-myc在脑胶质瘤组织中的表达及其相关性以及脑胶质瘤细胞中二者之间的调控关系。方法:Real-time PCR检测30例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FUBP1和c-myc的表达。设计并合成FUBP1基因特异性的siRNA,转染U251细胞。转染后,Western blot检测FUBP1和c-myc蛋白的表达。结果:与相应癌旁组织相比,胶质瘤组织中FUBP1和c-myc的表达均显著上调,二者呈显著正相关;转染siRNA-FUBP1后FUBP1和c-myc蛋白的表达均显著下调。结论:FUBP1和c-myc在脑胶质瘤中存在表达异常,而且二者的表达存在正相关性,FUBP1在脑胶质瘤细胞中能够上调c-myc的表达。

RNA干扰沉默Aurora A基因表达对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制人胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blotting检测Aurora A mRNA和蛋白的表达情况,同时利用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验和流式细胞仪观察转染后U251细胞增殖抑制率和细胞凋亡,透射电镜观察细胞凋亡超微结构改变。结果转染Aurora AsiRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低;U251细胞增殖的抑制率和细胞凋亡率显著增高(P<0.01),且U251细胞发生了显著的凋亡形态改变。结论体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功地抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡,提示Aurora A可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。

人脑胶质瘤细胞来源外泌体的提取鉴定及微环境中的摄取

目的探讨提取、鉴定及观察细胞对外泌体在微环境中的摄取,为后续开展胶质瘤外泌体相关的研究建立稳定的提取方法,以及更清楚地观察到外泌体奠定基础,为今后研究提供一定的参考。方法运用超速离心法从人脑胶质瘤细胞培养上清液中分离外泌体以及观察在肿瘤细胞微环境中肿瘤细胞对外泌体的摄取,通过透射电子显微镜观察外泌体的大小、形态特点,通过马尔文粒径分析确定外泌体粒径的大小,应用Western blotting法进行外泌体特异性抗原分子CD63、TSG101的鉴定,采用荧光共聚焦显微镜观察胶质瘤细胞摄取外泌体。结果通过透射电子显微镜观察到从人脑胶质瘤U251细胞的培养上清液中分离出来的呈圆形杯盘样结构的囊泡样物质,其外形呈典型的杯状和双凹圆盘的扁平球囊体且具备完整的膜结构,粒径大小为30~150 nm,Western blotting结果显示其表达外泌体特异性蛋白CD63、TSG101;外泌体通过细胞内吞噬作用形成、分泌和释放,通过荧光共聚焦显微镜可以证实其有效摄取外泌体,主要集中于细胞质。结论人脑胶质瘤U251细胞中提取分离得到具有双层膜结构茶托样囊泡物质,鉴定其为外泌体,并能观察细胞摄取外泌体集中分布于细胞质。

阿托伐他汀抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡:基于上调miR-146a表达与抑制PI3K/Akt信号通路

目的探究阿托伐他汀(AVT)对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及其对miR-146a/PI3K/Akt信号通路的作用。方法将人脑胶质瘤细胞U251分为4组:对照组(Conrtrol)、AVT组、AVT+转染miR-146a无关片段组(AVT+miR-146a NC)、AVT+转染miR-146a干扰组(AVT+miR-146a inhibitor)。Control组不加任何药物,AVT组加入8.0μmol/L的AVT,AVT+miR-146a NC组转染miR-146a NC后加入8.0μmol/L的AVT,AVT+miR-146a inhibitor组转染miR-146a inhibitor后加入8.0μmol/L的AVT。RT-PCR检测miR-146a表达,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况,Westernblot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果药物干预48 h,与Control组相比,AVT组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显升高(P<0.01),细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显降低(P<0.01)。与AVT组相比,AVT+miR-146a inhibitor组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显降低(P<0.01),细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显升高(P<0.01),AVT+miR-146a NC组上述指标无显著性差异(P>0.05)。结论AVT能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,其机制与上调miR-146a表达,抑制PI3K/Akt信号通路相关。