人Lrp蛋白在细胞中的定位及LPS对其表达的影响

为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western印迹表明,吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合,并有较高免疫印迹滴度,为Lrp功能研究提供了重要的工具.激光共聚焦扫描荧光显微镜检测显示Lrp主要位于细胞核膜周围.Western印迹、RT-PCR以及细胞免疫组化染色结果都表明,用LPS刺激后,lrp在人HEK293和U937细胞内的表达均有明显的上升.结果提示,Lrp可能与对Lrp介导的反应有关.

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体(lrpΔC)和突变体(lrpm)序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-lrp、pcDNA3.1(+)-lrpΔC和pcDNA3.1(+)-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示:人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3.1(+)。

TNF-α对人lrg基因表达的调控

目的:观察TNF-α对脂多糖应答基因(lrg)在人HEK293和U937细胞中表达的影响.方法:正常培养人胚肾细胞(HEK293)和人单核细胞(U937),用TNF-α(终浓度1×106U/L)刺激2h.提取刺激前后HEK293和U937细胞的总蛋白,用纯化后的兔抗人Lrg抗血清作一抗(1∶1000),对TNF-α刺激前后的HEK293和U937细胞进行Western Blot分析.提取刺激前后HEK293和U937细胞的总RNA,用RT-PCR分析TNF-α对lrg在细胞中表达的影响.以β-actin为内参.结果:Western Blot分析显示,用TNF-α刺激2h后,lrg在人HEK293和U937细胞内的蛋白含量明显上升;RT-PCR结果显示,用TNF-α刺激2h后,人HEK293和U937细胞内的lrg mRNA水平明显上升.结论:TNF-α的刺激增强了人HEK293和U937细胞内lrg的表达,提示lrg可能参与了TNF-α诱导的炎症反应.

LncRNA SNHG10对脂多糖诱导血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

目的探讨lncRNA SNHG10对脂多糖(LPS)诱导血管内皮细胞氧化应激损伤的影响。方法通过筛选出的LPS最适浓度500 ng/mL诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC,构建血管内皮细胞氧化应激损伤体外模型。取对数生长期的HUVEC细胞,分别将si-NC、si-SNHG10质粒转染至HUVEC细胞,采用LPS(500 ng/mL)处理(分别记为LPS+si-NC组、LPS+si-SNHG10组),选择未行任何处理的HUVEC细胞为Control组,仅加入500 ng/mL LPS处理的细胞为LPS组。CCK-8法、流式细胞术检测细胞活力和凋亡水平;RT-qPCR法检测小核仁RNA宿主基因10(SNHG10)相对表达量;Western blotting法检测Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达;ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量和SOD活性。结果LPS+si-SNHG10组HUVEC细胞活力、Ki-67蛋白、Bcl-2蛋白表达分别为(75.6±4.1)%、0.74±0.06、0.65±0.05,LPS+si-NC组分别为(45.4±2.8)%、0.52±0.04、0.42±0.03;LPS+si-SNHG10组SNHG10表达、细胞凋亡率、Bax蛋白表达、TNF-α、1L-6和1L-1β含量分别为1.88±0.11、(16.8±0.9)%、1.32±0.07、(289.2±25.1)pg/mL、(363.3±22.4)pg/mL、(402.6±21.3)pg/mL,LPS+si-NC组分别为3.24±0.19、(23.1±1.2)%、1.68±0.11、(536.6±33.0)pg/mL、(634.5±33.1)pg/mL、(664.5±38.1)pg/mL,LPS+si-SNHG10组SNHG10表达、细胞凋亡率、Bax蛋白表达、TNF-α、1L-6和1L-1β含量低于LPS+si-NC组(P均<0.05)。与Control组相比,LPS组HUVEC细胞内MDA表达升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);与LPS+si-NC组相比,LPS+si-SNHG10组HUVEC培养液MDA含量降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05)。结论干扰SNHG10表达可以减轻LPS诱导的HUVEC凋亡、炎症和氧化应激,促进细胞增殖。